שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA
Summary
פרוטוקולים מפורט עבור שני acylation במבחנה, בתא סלקטיבי 2′-הידרוקסיל נותחו על ידי פריימר ניסויים סיומת (צורה) כדי לקבוע את מבנה שניוני של רצפי ה-pre-mRNA עניין בנוכחות מולקולה קטנה פילוח RNA הם הציג במאמר זה.
Abstract
בתהליך של פיתוח תרופות של פילוח RNA מולקולות קטנות, שחקרתי את השינויים המבניים על האינטראקציות שלהם עם רצפי RNA יעד רצוי. בזאת אנו מספקים של נתונים היסטוריים במבחנה , בתא סלקטיבי 2′-הידרוקסיל acylation נותחו על ידי הארכת תחל (צורה) פרוטוקול ללמוד השינוי המבני RNA בנוכחות תרופה ניסיונית עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), הישרדות מוטור נוירון (SMN)-C2, ו ב אקסון 7 של pre-mRNA של הגן SMN2. בצורת גופית, רצף הרנ א של נוקלאוטידים 140 המכיל SMN2 אקסון 7 עיבד על ידי T7 RNA פולימראז, מקופל בנוכחותו של SMN-C2, שונה לאחר מכן על ידי תגובה כימית acylation מתון-2′ הו, 2-methylnicotinic imidazolide חומצה (NAI). זה adduct 2′-הו-נאי נוסף שנבדק על-ידי בגודל 32הארכת תחל התווית על-ידי P, נפתרת על-ידי אלקטרופורזה בג’ל לזיהוי (עמוד). לעומת זאת, 2′-הו acylation במצב בתא מתקיים באתרו עם RNA הסלולר SMN-C2 מאוגד בתאים חיים. רצף ה-pre-mRNA של אקסון 7 בגן SMN2 יחד עם צורה-induced מוטציות בהרחבה פריימר, היה אז מוגבר על-ידי ה-PCR ובכפוף הדור הבא רצפי. משווים את שתי מתודולוגיות, צורה במבחנה היא שיטה חסכונית יותר, לא דורשת כוח חישובית לדמיין תוצאות. עם זאת, הדגם RNA נגזר צורה במבחנה לפעמים סוטה מן המבנה משני בהקשר הסלולר, ככל הנראה בשל האובדן של כל האינטראקציות עם RNA מחייב חלבונים. הצורה בתאים אינו צריך מקום העבודה חומרים רדיואקטיביים ותשואות מבנה שניוני מדויקת יותר של RNA בהקשר הסלולר. יתר על כן, בתא בצורה ישימה כלל עבור רצפי טווח של RNA גדול יותר (~ 1,000 נוקלאוטידים) על-ידי ניצול רצפי הדור הבא, לעומת הפריה צורה (~ 200 נוקלאוטידים) כי בדרך כלל מסתמך על דף ניתוח. במקרה של אקסון 7 ב- SMN2 pre-mRNA, נגזר הצורה במבחנה, בתא RNA מודלים דומים אחד לשני.
Introduction
Acylation סלקטיבית-2′ הידרוקסיל נותחו על ידי הארכת תחל (צורה) היא שיטת מדידה של קינטיקה של כל נוקלאוטיד ברצף RNA עניין ולאחר שחקרתי את מבנה שניוני-נוקלאוטיד יחיד החלטה1. הצורה מתודולוגיות, שניהם תנאים במבחנה2,3,4 (מטוהרים RNA במערכת מאגר מוגדר), ב-5,בתרבית של תאים חיים6, פותחו כדי לחקור המשני מבנה של רצפי אורך בינוני RNA (בדרך כלל < 1,000 נוקלאוטידים עבור צורה בתוך תא, < נוקלאוטידים 200 עבור צורה במבחנה). זה שימושי במיוחד כדי להעריך את ביצוע שינויים מבניים קולטן ה-RNA על איגוד אינטראקציה-RNA מולקולה קטנה מטבוליטים2,4,7,8 , ללמוד פעולות מכניסטית של מולקולות RNA פילוח במהלך סמים פיתוח9,10.
פילוח RNA גילוי תרופות לאחרונה מושך תשומת לב במעבדות אקדמי ו11,בתעשייה הפרמצבטית12 באמצעות גישות שונות ואסטרטגיות13,14,15 ,16. דוגמאות פילוח RNA מולקולות קטנות לשימוש קליני האחרונות כוללות שתי תרופות ניסיוניות מבנית ברורים, LMI-07017 ו RG-791618,19, עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), אשר הראו מבטיח תוצאות בשלב II ניסויים קליניים20. היו שתי מולקולות הפגינו להישרדות היעד של נוירון מוטורי (SMN) 2 pre-mRNA ולווסת את התהליך splicing של17,216,ג’ין SMN2. אנחנו הפגינו בעבר היישום של במבחנה ואת הצורה בתא במבחן של השינויים המבניים היעד RNA בנוכחות אנלוגי של RG-7916 המכונה SMN-C26.
בעקרון, צורה מודד את שיעור acylation 2′-הו כל נוקלאוטיד של רצף הרנ א בנוכחות כמויות עודפות של ריאגנט acylation עצמית quenching בצורה בלתי לא משוחדת. הכימית acylation אינה יציבה במים, עם מחצית חיים קצר של (למשל, T1/2 = 17 s עבור 1-מתיל-7-nitroisatoic אנהידריד; או 1 מ’ 7, ~ 20 דקות עבור 2-methylnicotinic imidazolide חומצה, או נאי)22 ו חוסר רגישות לגבי זהותו של בסיסים23. התוצאה acylation יותר של קבוצות 2′-הו הבסיסים גמיש, אשר יכולה להיהפך הערכה מדויקת של כל נוקלאוטיד הדינמיקות. באופן ספציפי, נוקלאוטיד בזוג הבסיס הוא בדרך כלל מגיב פחות מזו אינטראקצית ל ריאגנט שינוי 2′-הו, נאי ו 1 מ’ 7.
מסתכל על המקור של התבנית RNA שם מתקיים acylation 2′-הו, צורה ניתן בדרך כלל לסווג במבחנה וצורה בתא. שימושים חוץ גופית צורה T7 מטוהרים עיבד RNA, חסר הקשר הסלולר בעיצובים ניסיוני. בצורת בתא, שעתוק RNA תבנית והן 2′-הו acylation מתרחשות בתוך תאים חיים; לכן, התוצאות ניתן לסכם המודל המבני RNA בהקשר הסלולר. הצורה בתא שהופנתה כמו vivo צורה עבור הצורה נשא בתאים חיים ספרות24. מאז הניסוי הזה לא מתבצע בחיה, אנחנו כינה את הניסוי הזה בתא הצורה על דיוק.
האסטרטגיות עבור השלב סיומת פריימר של הפריה וצורה בתא הם גם שונים. בצורת גופית, שעתוק במהופך עוצר המיקום acylation 2′-או בנוכחות Mg2 +. סיומת פריימר 32P-בעל התווית ולכן מופיע עם הלהקה ב לזיהוי בג’ל (עמוד), האינטנסיביות של הלהקה הוא יחסי קצב acylation1. בצורת בתא, שעתוק במהופך יוצר מוטציות אקראיות ב- 2′-. הו-adduct עמדה בנוכחות Mn2 +. קצב mutational של כל נוקלאוטיד ניתן ללכוד מאת עומק הדור הבא רצפי ולאחר מכן ניתן לחשב את תגובתיות צורה ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד.
בעיה פוטנציאלית עבור צורה בתא הוא יחס אות לרעש נמוך (קרי, רוב הקבוצות 2′-הו הוא שלא שונתה, ואילו רצפי יאומתו לכבוש את רוב קרא ב הדור הבא רצפי). לאחרונה, שיטה להעשיר 2′-. הו-שינוי RNA, המכונה כמו vivo לחץ על צורה (icSHAPE), פותחה על ידי מעבדה צ’אנג25. שיטה זו העשרה עשוי להיות יתרון בלימוד חלש מולקולות קטנות כגון אינטראקציות RNA, בפרט חקירה transcriptome ברוחב.
Protocol
Representative Results
Discussion
בצורת גופית, חיוני להשתמש בתבנית ה-RNA הומוגנית באיכות גבוהה. T7 שעתוק, עם זאת, לעיתים קרובות התשואות רצפים הטרוגנית36. במיוחד, רצפי עם נוקלאוטיד ±1 בקצהו 3′-עם תשואות שעצירת36 קשים בדרך כלל שיוסרו על-ידי לזיהוי ג’ל לטיהור. תבנית ה-RNA הטרוגניות עלולים לגרום קבוצה אחד או יו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה על ידי המענק NIH R01 (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
- Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
- Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
- Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
- Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
- Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
- Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
- Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
- Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
- Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
- Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
- Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
- Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
- Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
- Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
- Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
- Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
- Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
- Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
- Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
- Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
- Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
- Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
- Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
- Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
- Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
- Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
- Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
- Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
- Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
- Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).
