Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA
Summary
Protocolli dettagliati per entrambi in vitro e nelle celle selettivo 2′-idrossile acilazione analizzati dagli esperimenti di estensione (forma) di primer per determinare la struttura secondaria delle sequenze di pre-mRNA di interesse in presenza di una piccola molecola di RNA-targeting sono presentato in questo articolo.
Abstract
Nel processo di sviluppo di farmaci di RNA-targeting piccole molecole, delucidando i cambiamenti strutturali sulle loro interazioni con sequenze di RNA di destinazione desiderata. Forniamo qui una dettagliata in vitro e nelle celle selettivo 2′-idrossile acilazione analizzati di estensione dell’iniettore protocollo (forma) per studiare il cambiamento strutturale di RNA in presenza di un farmaco sperimentale per l’atrofia muscolare spinale (SMA), sopravvivenza di del neurone di motore (SMN)-C2 e in essone 7 del pre-mRNA del gene SMN2. In forma in vitro, una sequenza di RNA di 140 nucleotidi contenenti SMN2 essone 7 è trascritto da T7 RNA polimerasi, piegata in presenza di SMN-C2 e successivamente modificata da un reagente di acilazione mite 2′-OH, 2-methylnicotinic acido imidazolide (NAI). Questo complesso di 2′-OH-NAI è ulteriormente sondato da un 32estensione P-con l’etichetta dell’iniettore e risolto mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina). Al contrario, 2′-OH acilazione in forma nelle celle si svolge in situ con SMN-C2 associato RNA cellulare in cellule viventi. La sequenza di pre-mRNA dell’esone 7 del gene SMN2, insieme a forma-indotto mutazioni nell’estensione del primer, poi è stata amplificata dalla PCR e soggette a sequenziamento di nuova generazione. Confrontando le due metodologie, forma in vitro è un metodo più redditizio e non richiede potenza di calcolo per visualizzare i risultati. Tuttavia, il modello in vitro di RNA derivati da SHAPE a volte si discosta dalla struttura secondaria in un contesto cellulare, probabilmente a causa della perdita di tutte le interazioni con le proteine RNA-leganti. Nelle celle forma non ha bisogno di un posto di lavoro materiale radioattivo e produce una struttura secondaria di RNA più precisa nel contesto cellulare. Inoltre, nelle celle forma è solitamente applicabile per un più grandi sequenze di gamma di RNA (~ 1.000 nucleotidi) utilizzando il sequenziamento di nuova generazione, rispetto a in vitro forma (~ 200 nucleotidi) che di solito si basa sull’analisi della pagina. Nel caso dell’esone 7 in SMN2 pre-mRNA, la forma in vitro e nelle celle derivate RNA modelli sono simili tra loro.
Introduction
Acilazione di selettivo 2′-idrossile analizzati di estensione dell’iniettore (forma) è un metodo di misurazione la cinetica di ogni nucleotide in una sequenza di RNA di interesse e la struttura secondaria a singolo nucleotide risoluzione1. Metodologie di forma, sia in condizioni in vitro2,3,4 (RNA purificato in un sistema tampone definito) e in vivo le cellule di mammiferi5,6, sono stati sviluppati per indagare il secondario struttura delle sequenze di RNA di media lunghezza (in genere < 1.000 nucleotidi per forma nelle celle e < 200 nucleotidi per la forma in vitro). È particolarmente utile per valutare i cambiamenti strutturali nel recettore RNA legandosi al RNA-interacting piccola molecola metaboliti2,4,7,8 e a studiare azioni meccanicistiche di molecole di RNA-targeting durante droga sviluppo9,10.
RNA-targeting scoperta della droga ha recentemente attirato l’attenzione in laboratori accademici e l’industria farmaceutica11,12 tramite diversi approcci e strategie13,14,15 ,16. Esempi recenti di RNA-targeting di piccole molecole per uso clinico due farmaci sperimentali strutturalmente distinti, LMI-07017 e18,RG-791619, per atrofia muscolare spinale (SMA), che ha mostrato promettente Risultati in fase di test clinici II20. Entrambe le molecole sono state dimostrate per la sopravvivenza di destinazione del neurone di motore (SMN) 2 pre-mRNA e regolano il processo di splicing del SMN2 gene6,17,21. Precedentemente abbiamo dimostrato l’applicazione di in vitro e nelle celle forma un esame dei cambiamenti strutturali in presenza di un analogo di RG-7916 conosciuto come SMN-C26destinazione RNA.
In linea di principio, forma misura il tasso di acilazione di 2′-OH di ogni nucleotide di una sequenza di RNA in presenza di una quantità eccessiva di un reagente di acilazione auto-estinguente in modo imparziale. Il reagente di acilazione non è stabile in acqua, con una breve emivita di (ad esempio, T1/2 = 17 s per anidride acetica 1-metil-7-nitroisatoic; o 1 M 7, ~ 20 min per imidazolide acido 2-methylnicotinic, o NAI)22 e insensibilità all’identità del le basi23. In questo modo un più favorevole acilazione dei gruppi 2′-OH di basi flessibile, che possono essere trasformati in un’accurata valutazione delle dinamiche di ogni nucleotide. In particolare, un nucleotide in un base-accoppiamenti è solitamente meno reattivo rispetto ad uno spaiato di un reagente modificazione di 2′-OH, come NAI e 1 M 7.
Guardando l’origine del modello RNA e dove si svolge la 2′-OH acilazione, forma possa essere classificato generalmente in forma in vitro e nelle celle. In vitro forma utilizza purificata T7 trascritti di RNA e manca un contesto cellulare in disegni sperimentali. A forma di nelle celle, 2′-OH acilazione sia la trascrizione del RNA modello si verificano nelle cellule viventi; di conseguenza, i risultati possono ricapitolare il modello strutturale di RNA in un contesto cellulare. FORMA nella cella è stato indicato come in vivo forma per la forma riportata in cellule viventi nella letteratura24. Dal momento che questo esperimento non viene eseguito in un animale, abbiamo chiamato questo esperimento come forma nella cella per precisione.
Le strategie per la fase di estensione del primer di forma in vitro e nelle celle sono anche differenti. A forma di in vitro, trascrizione d’inversione si ferma nella posizione di acilazione di 2′-OH in presenza di Mg2 +. Un’estensione dell’iniettore 32P-labled appare quindi come una band in elettroforesi su gel di poliacrilamide (pagina) e l’intensità della banda è proporzionale al tasso acilazione1. A forma di nelle celle, trascrizione inversa genera mutazioni casuali presso la 2′-OH del complesso posizione in presenza di Mn2 +. Il tasso mutazionale di ogni nucleotide può essere catturato nel sequenziamento di nuova generazione di profondità, e la reattività di forma a singolo nucleotide risoluzione può quindi essere calcolata.
Un potenziale problema per la forma nella cella è il rapporto segnale-rumore basso (cioè, una maggioranza dei gruppi 2′-OH è invariata, mentre le sequenze non modificate occupano la maggior parte delle leggi nel sequenziamento di nuova generazione). Recentemente, un metodo per arricchire la 2′-OH per volta RNA, indicato come in vivo, fare clic su forma (icSHAPE), è stato sviluppato dai Chang laboratorio25. Questo metodo di arricchimento può essere vantaggioso nello studio debole piccole molecole quali interazioni RNA, soprattutto in un interrogatorio del trascrittoma-wide.
Protocol
Representative Results
Discussion
In forma in vitro, è fondamentale utilizzare modello RNA omogeneo di alta qualità. Trascrizione di T7, tuttavia, spesso produce sequenze eterogenee36. Soprattutto, sequenze con ± 1 nucleotidi al 3′-terminale con rendimenti non trascurabile36 sono solitamente difficili da rimuovere dalla purificazione del gel di poliacrilammide. Modello di RNA eterogeneo può causare più di un set del segnale del sequenziamento gel profilo del prodotto primer extension, che a volte rende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile dalla concessione NIH R01 (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
- Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
- Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
- Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
- Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
- Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
- Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
- Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
- Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
- Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
- Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
- Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
- Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
- Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
- Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
- Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
- Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
- Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
- Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
- Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
- Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
- Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
- Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
- Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
- Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
- Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
- Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
- Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
- Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
- Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
- Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).
