고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법
Summary
여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜에서 우리를 ultracentrifugation 또는 무차별 세제의 사용 없이 U937 세포의 subcellular 분수를 받는 방법을 자세하게. 이 메서드 사용 소형 버퍼, digitonin, 기계적인 세포 및 세포질, 미토 콘 드리 아 및 원형질 막 분리 차등 원심 분리 합니다. 과정은 연구자의 요구에 맞게 확장할 수 있습니다, 그리고 저렴 하 고 간단. 이 메서드는 특수 원심 분리기와 둘 다 엄청나게 비쌀 수 있는 상업용 키트를 사용 하지 않고 셀에 단백질 지 방화를 결정 하기 위해 연구원 수 있게 됩니다. 성공적으로 인간 monocyte 셀 라인 U937이 cytosolic 분리 하는 방법, 원형질 막 및 미토 콘 드리 아 단백질 사용 했습니다.
Introduction
단백질 지 방화의 신뢰할 수 있는 id는 진 핵 세포에 있는 분자 통로 조사할 때 경우가 많습니다. 방법 subcellular 분수를 더 밀접 하 게 검사 세포 구성 성분의 연구자에 의해 활용 됩니다.
기존의 셀 분류 방법의 대부분은 일반적으로 두 개의 넓은 범주로, 세제 기반1,2 , ultracentrifugation 기반3,,45, 될 수 있는 속도, 정확성 및 비용에 의해 분화 된다. 셀의 고유 구성 요소를 solubilize 세제 힘 증가 함께 버퍼의 사용에 의존 하는 세제 기반된 프로토콜. 이 샘플을 처리 하는 신속 하 고 편리한 방법 이며, 비용 효과적일 수 있다 수와 샘플의 크기는 작은 하는 경우. 세포질, 막/세포 기관이 (혼합된 분수), 및 세포에서 핵 분수 분리 세제 기반 키트를 구입할 수 있습니다. 그러나, 이러한 장비와 관련 된 몇 가지 단점이 연구원에 게 그들의 유용성을 제한 한다. 그들은 쉽게 셀의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 분리 하도록 설계 되었습니다 하지만 샘플에서 모든 분수를 동시에 차단 할 수 있다. 세제의 사용 의미는 원형질 막과 세포 막 동봉 하는 것입니다 수 똑같이 solubilized 및, 그러므로, 서로에서 분리 될 수 없습니다. 추가 합병증이 키트 연구원은 특정 응용 프로그램에 대 한 조건을 변경 하지 못하도록 독점 구성 요소에서 발생 합니다. 마지막으로, 그들은 사용에 제한 되 고 엄청나게 큰 규모의 실험에 대 한 비용이 있을 수 있습니다. 그러나 비 세제 기반된 키트 미토 콘 드리 아의 격리에 대 한 존재,, 원형질 막 분리 설계 되지 않았습니다 및 샘플 수율은 훨씬 밀도 원심에서 저것 보다는 더 적은 격리 프로토콜6,7 기반으로 .
분수를 ultracentrifugation를 사용 하는 메서드는 더 시간이 소모, 하지만 종종 세제 기반 키트 보다 순수한 분수에 결과. 그들 뒤에 세포질 분 대를 통해 차동의 분리 비 세제 메서드에서 lysed 첫 solubilizing 그들 (막 세포와 오염 결과로) 하지 않고 셀에서 플라즈마 막 분리 필요 원심 분리-원형질 막 절연 요구를 달성 하기 위해 100000 × g 의 속도. 대부분의 경우, isopycnic 밀도 그라데이션 원심 분리 추가 대 한 셀룰러 분수 또는 오염 물질의 제거의 차등 원심을 뒤 합니다. 이러한 방법은 철저 하 고 수정할 수 있지만, 단점 등 비용, 시간 소비, 분수와 더 정화를 통해 밀도 그라데이션 원심 분리에 대 한 ultracentrifuge에 대 한 필요. 대부분 고속 원심 분리기는 개별 조사와는 종종 교육 기관에서 장비를 코어 공유, 금지는 비용에 있습니다. 따라서, ultracentrifuge 가용성 이러한 상황에서 금지 된다.
이 분류 프로토콜 solubilizing 세제의 사용 없이 및 고속 원심 분리 하지 않고 subcellular 분수의 보여 줍니다. 이 메서드는 원형질 막, 미토 콘 드리 아 및 분수 사이 최소한의 오염으로 진 핵 세포의 세포질 구성 요소를 분리 하는 연구자 수 있게 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 개발은 미토 콘 드리 아를 분리 하는 무 능력 하 고 막 샘플, necroptosis14동안 단백질 지 방화의 분석을 위해 상용 키트를 사용 하 여에서 발생 했다. Premade 키트의 주요 한계는 그들의 무 능력 개인 연구자의 요구에 적응 될 샘플 및 샘플 처리 수의 제한 된 수의 비용. 비싼 시 약의 사용과 고가의 장비에 대 한 필요성 없이 여기에 제시 된 메서드를 수행할 수 있습니다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작업은 NIH-1R15HL135675-01 티모시 J. LaRocca에 의해 지원 되었다
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
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