Un'analisi di Micro-neutralizzazione del Virus respiratorio sinciziale (RSV) migliorata e ad alta velocità di trasmissione
Summary
Questo studio descrive un throughput elevato, basato su formazione immagine di analisi di micro-neutralizzazione per determinare il titolo degli anticorpi neutralizzanti specifici per il virus respiratorio sinciziale (RSV). Questo formato di dosaggio è stato testato su tipi di campioni diversi.
Abstract
Respiratori sinciziali virus-specifici anticorpi neutralizzanti (RSV NAbs) sono un indicatore importante di protezione contro RSV. Un numero di formati diversi test è attualmente in uso in tutto il mondo c’è un’esigenza di un metodo preciso e ad alta produttività per la misurazione NAbs RSV. Descriviamo qui un’analisi micro-neutralizzazione basato su formazione immagine che è stata testata su sottogruppo RSV A e può essere adattata anche per RSV sottogruppo B e tipi di campioni diversi. Questo metodo è altamente riproducibile, con variazioni inter-saggio per l’antisiero di riferimento inferiore al 10%. Crediamo che questo test può essere facilmente stabilito in molti laboratori in tutto il mondo a costi relativamente bassi. Sviluppo di un’analisi migliore, ad alta produttività che misura RSV NAbs rappresenta un significativo passo avanti per la normalizzazione di questo metodo a livello internazionale, oltre ad essere critici per la valutazione di nuovi candidati vaccinali di RSV in futuro.
Introduction
Virus respiratorio sinciziale (RSV) è la causa principale delle infezioni più basse delle vie respiratorie nella popolazione pediatrica in tutto il mondo1. Nonostante la sua alta difficoltà, non c’è ancora nessun vaccino o trattamento disponibile. Dal 2013, l’organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha dichiarato lo sviluppo di vaccini di RSV come una priorità di ricerca principali, con annuale WHO consultazione riunioni2,3. L’OMS ha concordato sull’utilizzo RSV neutralizzando misura dell’anticorpo (NAb) per monitorare l’immunogenicità del vaccino, come questo è riconosciuto come il principale marker sierologico di protezione4. NAbs hanno dimostrato di proteggere contro l’infezione RSV severa in un certo numero di studi, nonché a studi clinici di palivizumab l’anticorpo monoclonale anti-RSV, attualmente la strategia solo profilattico disponibili4.
Ci sono diversi formati di dosaggio NAb usati dai laboratori in tutto il mondo, tra cui saggi basati su molecolare e cellulare, che hanno compiuto sforzi di standardizzazione impegnativo5,6,7,8. Tuttavia, l’analisi di neutralizzazione (PRN) riduzione della placca convenzionale che misura il numero di riduttore della placca formando unità (PFU) dalla presenza di un anticorpo specifico RSV rimane ancora il gold standard9. Qui, segnaliamo un protocollo PRN migliorato, semplificato e ad alta velocità che può essere utilizzato su numerose linee cellulari, per diversi ceppi di RSV e con un throughput di dosaggio aumentato. Questo protocollo è stato testato utilizzando campioni clinici da impostazioni diverse, come pure su campioni provenienti da esperimenti di modello animale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato e ottimizzato un’analisi di micro-neutralizzazione di RSV semplice ed efficiente che può essere facilmente adattata nella maggior parte dei laboratori. Questo test è in grado di misurare la capacità di infezione virale così come l’inibizione di infezione virale di NAb a livello cellulare mediante scansione immagine automatizzata di misura. L’uso di una piattaforma basata su formazione immagine e sistemi basati su anticorpi specifici ha aumentato la specificità e la sensibilità di rilevazione spot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano tutti i partecipanti coinvolti. Riconosciamo il programma di supporto dell’infrastruttura operativa del governo vittoriano. PVL è un destinatario NHMRC carriera sviluppo Fellowship.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
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- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
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