향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과
Summary
높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.
Abstract
호흡 syncytial 바이러스는 특정 중화 항 체 (RSV NAbs)는 RSV에 대 한 보호의 중요 한 표식. 다른 분석 결과 형식의 번호에에서는 현재 전세계 사용 이므로 RSV NAbs 측정 하기 위한 정확 하 고 높은 처리 방법에 대 한 필요. 여기는 영상 기반 마이크로 중화 분석 결과 RSV 하위 그룹 A에서 테스트 되었습니다와 RSV 하위 그룹 B 및 서로 다른 샘플에 대 한 또한 적응 수 있습니다 설명 합니다. 이 방법은 매우 재현성, 참조 원으로 10% 미만 대 한 상호 분석 결과 유사 합니다. 우리는이 분석 결과 많은 실험실에서 상대적으로 저렴 한 비용으로 전세계에 쉽게 설치 될 수 있다 믿습니다. RSV NAbs 측정 개선, 높은 처리량 분석 결과의 개발 뿐만 아니라 소설 RSV 백신 후보자의 평가 미래에 대 한 중요 한 되 고 국제적으로이 방법의 표준화에 대 한 중요 한 단계를 앞으로 나타냅니다.
Introduction
호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 소아 인구 세계1에 더 낮은 호흡 기관 감염의 주요 원인입니다. 그것의 높은 부담에도 불구 하 고 아직 아무 백신 이나 치료 가능한 있다. 2013 년 이후 세계 보건 기구 (WHO)는 주요 연구 우선 순위, 연간 WHO 상담 회의2,3로 RSV 백신 개발을 선언 했다. WHO는 RSV 중화 항 체 (NAb) 측정 모니터를 사용 하 백신 immunogenicity로 보호4의 주요 혈 청 학적인 감 적으로 인식 되 고이에 동의 했다. NAbs 안티-RSV 단일 클론 항 체 palivizumab, 현재만 예방 전략 사용 가능한4의 임상 시험 연구의 숫자에 가혹한 RSV 감염 으로부터 보호 하기 위해 표시 되었습니다.
5,6,,78도전 표준화 노력 만든 세포 및 분자 기반 분석을 포함 한 전세계 실험실에 의해 사용 되는 여러 NAb 분석 결과 형식을 확인 하 고 있습니다. 그러나, RSV 특정 항 체의 존재에 의해 감소 된 플 라크 형성 단위 (PFU)의 수를 측정 하는 기존의 플 라크 감소 중화 (PRN) 분석 결과 금9아직도 남아 있다. 여기, 우리는 향상 된, 단순화, 및 높은 처리량 PRN 프로토콜 다른 RSV 긴장 증가 분석 결과 처리량과 수많은 셀 라인에 사용할 수 있는 보고 합니다. 이 프로토콜은 임상 샘플 다른 설정에서 뿐만 아니라 동물 모델 실험에서 샘플을 사용 하 여 테스트 되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리가 개발 하 고 최적화는 간단 하 고 효율적인 RSV 마이크로 중화 분석 결과 대부분 실험실에서 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 분석 결과 컴퓨터 이미지 검색을 사용 하 여 세포 수준에서 NAb 바이러스 성 감염의 억제를 측정 뿐만 아니라 바이러스 감염 능력을 측정할 수 있다. 이미징 기반 플랫폼 및 특정 항 체 기반 시스템을 사용 하 여 특이성 및 전통적인 패 감지 방법6,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 모든 참가자를 참여 감사합니다. 우리는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램을 인정합니다. PVL은 NHMRC 경력 개발 장학금 받는 사람입니다.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
