Улучшенная и высокой пропускной способности Assay микро нейтрализация респираторно-синцитиальный вирус (RSV)
Summary
Это исследование описывает высокую пропускную способность, на основе изображений микро нейтрализация пробирного определить титр нейтрализующих антител специфических для респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Этот assay формат был протестирован на различных образцов типов.
Abstract
Органов дыхания-синцитиальный вирус специфических нейтрализующие антитела (RSV NAbs) являются важным маркер защиты против RSV. Количество различных пробирного форматов в настоящее время используются во всем мире так что необходимо для точной и высок объём метода измерения RSV NAbs. Мы опишем здесь на основе изображений микро нейтрализация assay который был протестирован на RSV подгруппы A и также может быть адаптирована для RSV подгруппы B и различные примеры типов. Этот метод является весьма воспроизводимость, с вариациями между анализами для ведения антисыворотки, менее 10%. Мы считаем, что этот assay может быть легко установлена во многих лабораториях во всем мире при относительно низких затратах. Разработка улучшилось, высок объём assay который измеряет RSV NAbs представляет собой значительный шаг вперед для стандартизации этот метод на международном уровне, а также имеют решающее значение для оценки Роман RSV вакцина кандидатов в будущем.
Introduction
Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является ведущей причиной инфекции нижних дыхательных путей в педиатрической населения во всем мире1. Несмотря на его высокое бремя существует до сих пор нет вакцины или лечения доступны. С 2013 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила RSV вакцина развития как приоритет крупных исследования, с ежегодной встречи ВОЗ консультации2,3. ВОЗ согласовали использование RSV, нейтрализуя антитело (NAb) измерения для мониторинга иммуногенность вакцины, как это признается в качестве основных серологических маркеров защиты4. Цапает было показано, чтобы защитить от тяжелой инфекции RSV в ряде исследований, а также клинические испытания palivizumab анти RSV моноклональных антител, в настоящее время только профилактические стратегии доступны4.
Есть несколько форматов пробирного NAb, используемых в лабораториях во всем мире, в том числе на основе клеток и молекулярные анализы, которые предприняли усилия стандартизации сложной5,6,,78. Однако обычные налета снижение нейтрализации (PRN) assay, который измеряет количество сокращение зубного налета, образуя единиц (ОРП) присутствие RSV-специфические антитела остается золотой стандарт9. Здесь мы приводим улучшение, упрощенная и высок объём PRN протокол, который может использоваться в многочисленных клеточных линий, с повышенной пробирного пропускную способность различных штаммов RSV и. Этот протокол был протестирован с помощью клинических образцов из различных параметров, а также на образцах из животных модельных экспериментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали и оптимизированы простой и эффективный RSV микро нейтрализация assay, который может быть легко адаптирована в большинстве лабораторий. Этот assay возможность измерить способность вирусной инфекции, а также измерения ингибирования вирусной инфекции на NAb на клеточном уровне, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят всех участников. Мы признаем правительство викторианской оперативной инфраструктуры поддержки программы. ПВЛ является получателем NHMRC стипендий развития карьеры.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
