경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 생존 모니터링

요약

여기, 선물이 단일 셀 기준 생존을 모니터링 하 고 크게 세포 죽음을 예측 하는 변수를 식별 하는 프로토콜.

초록

표준 세포 독성 분석 실험, 여러 시간 점에서 고정된 세포 lysates의 필요, 감도 및 신경 운명에 영향을 주는 요소를 평가 하는 능력을 제한 했다. 이 분석 실험 개별 시간 포인트에서 세포의 별도 인구의 관찰을 해야합니다. 그 결과, 개별 셀 지켜질 수 없다 prospectively subcellular 이벤트, puncta 형성 등 단백질 mislocalization, 질병, 병원 성 드라이버 homeostatic 응답 인지를 구별할 수 있는 능력을 가혹 하 게 제한 하는 시간이 지남에 또는 단순히 우연 현상입니다. 단일 셀 경도 현미경 연구원 인구 사이 생존에 차이 확인 하 여 향상 된 감도와 인과 관계를 그릴 수 있도록 이러한 한계를 극복 한다. 이 비디오 가이드는 형광 단백질 마커를 표현 하는 쥐 주 대뇌 피 질의 뉴런의 단일 세포 생존을 측정 하는 실험에 대 한 대표적인 워크플로 개요 것입니다. 뷰어는 transfections 높은 효율을 달성, 수집 및 개별 셀의 예비 추적을 사용 하면 이미지를 처리 하는 방법을 배울 것 이다 고 신경 인구 콕스 비례 위험 분석을 사용 하 여의 상대 생존 됩니다.

서론

비정상적인 세포 죽음은 암, 뇌졸중¹, neurodegeneration, 등 많은 질병에 영향을 미치는. 세포 죽음에 대 한 강력 하 고 중요 한 분석 확장 하거나 세포 생존을 감소 시키기 위한 치료 전략의 개발으로 서 이러한 장애의 특성에 필수적입니다. 현재 직접 또는 대리 마커²세포 죽음을 측정 하기 위한 기법의 수십 있습니다. 예를 들어 세포 죽음 평가 될 수 있다 시각적으로 또는 특정 인지질 원형질 막^{4,5,6의 모습을 모니터링 하 여 중요 한 염료를 선택적으로 죽 었 거 나 살아있는 세포3, 얼룩의 도움으로} . 측정 세포내 구성 요소 또는 셀룰러 산시 미디어로 출시 세포 대사 산물의 세포 죽음^7,8에 대 한 프록시 사용할 수 있습니다. 또는, 세포 생존 수 수 직선 근사 줄 대사 활동^9,10

프로토콜

모든 척추 동물 작업 사용 및 미시간 대학 (프로토콜 # PRO00007096)에서 관리 동물에 위원회에 의해 승인 되었다. 실험 동물 희생의 수를 최소화 하기 위해 신중 하 게 계획 된다. 임신 여성 야생-타입 (WT), 유전자 변형 비 긴 에반스 쥐 (Rattus norvegicus)는 실 환경 풍부 및에 단위에 대 한 실험 동물 의학 (ULAM) 미시간 대학에 의해를 걱정에서 홀로 지 내게 따라 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 게 NIH 지원 가이드 모든 쥐 안락사, 안락사의 미국 수의 의학 협회 그리고 미시간 대학에 대 한 지침의 권고와 일치 하기 전에 가능한 짧은 시간에 의해 안락사의 방법 하우징 루틴에 보관 했다 종 지침입니다.

1. 재료 준비

1. 19-20 쥐 새끼와 문화^{13,14, 이전에 설명 된 대로 x 106 셀 4 일에서 생체 외에서폴 리-D-리 코팅된 판에 밀리 리터 당 0.5에서 대뇌 피 질의 뉴런 쥐 배아 일에서 대뇌 피 질의 신경 해 부 15,,}

결과

여기 설명 된 transfection 절차를 사용 하 여, DIV4 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 형광 단백질 mApple 인코딩 플라스 미드와 페 했다. 시작 24 시간 후 transfection, 세포 했다 몇 군데 형광 현미경 검사 법 모든 24 h에 의해 10 일 연속. 결과 이미지 다음 그림 2에 표시 된 대로 구성 했다 물 렸 다, 스택, 및 세포 죽음 (그림 1)에 대 한 득점. 그림 3 은 시간 코스 3 대표 뉴런에 대 한 세 번째 동안 실험 (신경 1과 2)의 과정을 다이의 두 통과 (신경 3).

생존 데이터 (생존 제공 하는 R 스크립트를 사용 하 여 분석 했다. R), 그리고 .......

토론

여기, 직접 단일 셀 기준 신경 생존을 모니터링 하는 방법론을 제시 합니다. 이 방법은 다양 한 세포 형태학, 단백질 표정, 지역화 등 요인의 지속적인 평가 대 한 수 있는 전통적인 분석 실험 세포 죽음에 대 한 개별 시간 포인트 및 셀의 전체 인구는, 달리 고 어떻게 각 요소 잠재 방식으로 세포 생존에 영향을 확인할 수 있습니다.

이 방법론은 다양 한 실험적인 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 주파수 및 이미징의 기간 쉽게 조정 될 수 있다, 그리고 관심의 모든 단백질 단백질 기능^{13,,1415, 조사 하거나 질병 상태를 형광 표시와 함께 공동 transfected 수 16,17.......}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Neurobasal 매체	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep 플라스미드 맥시 키트	Qiagen	12863
염화마그네슘 육수화물	시그마	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
폴리 D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 보충제	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140122
96 웰 플레이트	TPP	0876