Identifikation af roman CK2 Kinase substrater ved hjælp af en alsidig biokemiske tilgang
Summary
Formålet med denne protokol er at mærke, berige og identificere substrater af protein kinase CK2 fra en kompleks biologisk prøve celle lysate f.eks væv homogenatet. Denne metode udnytter unikke aspekter af CK2 biologi til dette formål.
Abstract
Studiet af kinase-substrat relationer er afgørende for at få en komplet forståelse af funktioner af disse enzymer og deres downstream mål i både fysiologiske og patologiske stater. CK2 er en evolutionært bevarede Serin/Threonin kinase med en voksende liste af hundredvis af substrater involveret i flere cellulære processer. På grund af sine pleiotrope egenskaber, identifikation og karakterisering af et omfattende sæt af CK2 substrater har været særligt udfordrende og forbliver en hurdle i studiet af dette vigtigt enzym. For at tage denne udfordring op, har vi udtænkt en alsidig eksperimentelle strategi, der muliggør målrettet berigelse og identifikation af formodede CK2 substrater. Denne protokol drager fordel af den unikke dual Co substrat specificitet af CK2 giver mulighed for specifikke thiophosphorylation sit underlag i en celle eller væv lysate. Disse substrat proteiner er efterfølgende alkylerede, immunoprecipitated, og identificeret af liquid chromatography/tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Vi har tidligere brugt denne tilgang til med held identificere CK2 substrater fra Drosophila æggestokke og her vi udvide anvendelsen af denne protokol på menneskelige glioblastom celler, illustrerer tilpasningsevne af denne metode til at undersøge de biologiske roller af denne kinase i forskellige modelorganismer og eksperimentelle systemer.
Introduction
Protein kinaser er vigtige komponenter i signaltransduktion cascades. Fosforylering af substrat proteiner af disse enzymer fremkalder biologiske svar, der regulerer kritiske begivenheder kontrollerer celledeling, stofskifte og differentiering, blandt andre. CK2 er en allestedsnærværende udtrykt, acidophilic Serin/Threonin kinase der er bevaret fra gær til mennesker og der spiller vigtige roller i mange cellulære processer lige fra transkriptionel regulering til cellecyklus progression til apoptose1 ,2,3. Enzymet er en heterotetramer bestående af to katalytiske α (eller α’) subunits og to lovgivningsmæssige β underenheder4. Ud over at være meget pleiotrope, udstiller CK2 to andre usædvanlige egenskaber at komplicerer sin analyse, nemlig konstitutiv aktivitet5 og dobbelt Co substrat specificitet6. Denne sidstnævnte egenskab forlener CK2 med mulighed for at bruge GTP samt ATP for fosforylering af substrat proteiner.
Genetiske sletning af de katalytiske eller administrative underenheder af CK2 i mus resultater i embryonale dødelighed viser, at det spiller afgørende roller i udviklingen og organogenesis7,8. CK2 er også overexpressed i flere typer af kræft og dermed udgør en lovende terapeutiske mål9,10,11. Faktisk, specifikke hæmmere at mål CK2 kinase aktivitet er i øjeblikket under efterforskning for dette formål12,13,14. Mens hæmning af CK2 er en farbar vej, sin pleiotrope karakter, et alternativ og er måske mere rationel tilgang til at målrette kritiske CK2 substrater, der ligger til grund for progression af visse kræftformer. Derfor, omfattende identifikation og karakterisering af CK2 substrat proteiner ville være til betydelig gavn for belyse den specifikke funktioner af denne kinase inden for en bestemt væv eller tumor type.
Her, beskriver vi en alsidig biokemiske metode til at identificere CK2 substrater fra en komplekse biologiske prøve en celle eller væv lysate. Denne protokol udnytter dual Co substrat specificiteten af CK2 ved brug af GTP analog GTPγS (Guanosinmonofosfat 5′-[γ-thio]triphosphate), som andre endogene kinaser ikke kan bruge. Dette giver effektivt kinase at “mærke” sin substrater i denne prøve for efterfølgende isolation og identifikation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskriver vi en relativt simpel biokemiske metode til at identificere substrater af protein kinase CK2 fra et komplekst biologisk prøve. De kritiske trin i denne protokol er baseret på de usædvanlige enzymatisk egenskaber af CK2 og omfatter CK2-afhængige thiophosphorylation af specifikke substrat proteiner ved hjælp af GTPγS og deres efterfølgende immunoprecipitation og identifikation. Med disse resultater, har vi bevist nytte og alsidighed af denne tilgang, som vi nu har anvendt denne strategi i bå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet i en del af Commonwealth Universal forskning Enhancement tilskud fra Pennsylvania Department of Health til T.I.S.
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. 암 연구학. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
