고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

요약

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

초록

매우 활성화 된 면역 세포의 조직 축적 압도적인 다양 한 만성 염증 성 질환의 특징을 대표 하 고 영향을 받는 환자의 임상 관리에 매력적인 치료 대상으로 등장. 프로-염증 성 면역 세포의 병 적 불균형 조직 침투의 치료 규제를 목표로 하는 전략을 더욱 최적화 하기 위해서는 그것은 향상 된 통찰력으로 질병 및 기관 관련을 달성 하기 위해 특별 한 중요성의 될 것입니다. 주변 세포의 속성을 추적 합니다. 여기 설명된 실험 프로토콜 papain 유도 폐 염증의 맥락에 놓여있는지 레이블 및 adoptively 전송 인간 림프 톨의 폐 축적을 모니터링할 수 있습니다. 면역 세포 이동과 chemotaxis 분석을 위해 자주 사용 표준 생체 외 분석 실험, 달리 지금 소개 vivo에서 설정 계정 폐 관련 조직 조직 및 복잡 한 염증의 영향으로 걸립니다. 시나리오 murine 생명체에서 일어나입니다. 또한, 3 차원 횡단면 빛 시트 형광 현미경 이미징만 양적 데이터, 면역 세포를 침투에 제공 하지 않습니다 하지만 또한 염증이 폐 내에서 면역 세포 지역화의 패턴을 보여 줍니다. 전반적으로, 우리는 제공 된 단계별 프로토콜에 따라 쉽게 적용 될 수 있는 만성 염증 성 폐 질환의 분야에서 면역학 연구에 대 한 높은 값의 혁신적인 기술을 소개 수 있습니다.

서론

알레르기 천식 등 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐의 고전적인 염증 성 질환으로 폐 조직^1,2활성화 된 림프 톨의 증가 채용에 의해 구동 잘 알려져 있습니다. 림프 구 출시 cytokines (예를 들어, 일리노이-4, IL-5, 일리노이-9, IL-13, TNF-α와 IFN-γ) 더 타고 난 및 적응형 면역 세포의 chemotaxis를 홍보, 거리 기도 개장을 유도 하거나 직접 폐 실질²손상. 지금까지, 폐 조직 내에서 세포의 병 적인 축적에 대 한 책임 기본 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지. 조직 선택적 T 세포 각 인 그리고 피부 본질적인 유도 대 한 설명에 비유, 폐 모 수석 세포 (DCs)는 분명히에 적어도 분할 CCR4 식의 유도 통해 우선 폐 침투에 대 한 주변 T 세포를 수는 림프 톨³의 표면입니다. CCR4, 외 기도 침투 T 세포는 CCR5와 CXCR3 주변 혈액^1,,45내의 T 세포에 비해 chemokine 수용....

프로토콜

실험 동물 관련 된 프로토콜 (Regierung 폰 인 운터 프랑 켄, 부츠 부르 크, 독일) 에를랑겐에서 관련 지방 자치 단체에 의해 승인에 따라 수행 했다. 마우스는 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다. 인간의 혈액의 수집 지역 윤리 위원회 에를랑겐 뉘른베르크의 대학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 각 환자 서 면된 동의 했다.

1. 쥐에서 알레르기 폐 염증 유발

참고: 이전 연구²⁷에 설명 된 대로 다음 실험 절차 쥐에서 알레르기 기도 염증 유도 있으며, 따라서 BAL에서 타고 난 및 적응형 면역 세포의 축적을 트리거합니다. 설명된 프로토콜 C57BL/6J 마우스에서 설립 되었습니다 하지만 다른 표준 타고 난된 긴장에 입양 가능 해야 한다.

그림 1A 생체 조건 실험 절차의 요약에 대 한 참조 하십시오.

1. 케 타 민/xylazine의 복 주입 하 여 쥐를 anesthetize.
   참고: 적어도 16 g의 몸 ....

결과

제시 프로토콜 모니터링 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 통해 폐에 adoptively 전송된 인간 T 림프 톨의 축적을 측정 하는 실험 마우스 모델을 설명 합니다. 그림 1 A 생체 조건 실험 일정 단계의 도식 개요를 제공 합니다. 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위하여 그것은 좋은 품질은 절연 및 붙일 수 있도록 상당한 중요성의 표시 인간의 CD4⁺ T 세포, 이후에 쥐로 전송 됩니다. 그림 1B, C, microbead 기반 셀 농축 및 후속 형광-라벨 일반적으로 위의 설명된 절차에 대표적으로 묘사 된 흐름 cytometrically에서 결과 결정 CD4⁺ T 셀 순도 > 95% 그리고 성공적인 형광 모든 CD4의 라벨⁺ T 세포. 빛-시트 형광 현미경의 품질과 침투 깊이 비판적으로 조직 비운.......

토론

여기 설명된 실험 설정 제공 고전적인 vivo에서 염증 성 조건 및 그로 인하여 relevantly 보완 기본 인간의 면역 세포의 유도 폐 용량을 모니터링 하는 기회가 chemotaxis를 수행 하는 생체 접착 분석 실험입니다. 폐의 계정 특정 해부학 기관 특성 고려, 임상 관련성 및 수집 된 데이터의 양도 (를 포함 하 여 대상 기관 안에 chemotaxis 및 셀 유통) 귀환 하는 면역 세포의 중요 한 측면 우리 했다 3 기술적인 주요 기능: (1) 분석 murine 생명체; 내 기본 인간 세포의 (2) papain 중재 유도의 폐 염증; 그리고 삭제 된 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (3).

비록의 기능 연구는 adoptively 인간의 전송 살아있는 murine 유기 체 내의 면역 세포 상호 작용 수용 체 ligand-쥐와 남자, 일반적인 개념 사이에서 잠재적으로 관련 된 비 호환성으로 인해 몇 가지 측면에서 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agarose NEEO Ultra	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45	antibody BioLegend, San Diego, USA	304060
염화암모늄	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	K2981
Cannula 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	301300
세포 증식 염료 eflour670	eBioscience Inc., San Diego, USA	65-0840-85
CD4 MicroBeads, human	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	8043.1
Potassium-EDTA 혈액 수집 튜브, 9 mL	Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일	21066001
Ethly cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte	PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany	P40-47500
Filter 100 µ 엠	VWR International Germany GmbH, 다름슈타트, 독일	732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2	Bitplane AG, Zurich, Switzerland	n.a.ImspectorPro
software	Abberior Instruments GmbH, Gö 팅겐, 독일	n.a.Ketamin
	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany	3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II	LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany	n.a.MACS
MultiStand	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-303
멀티플라이 캐뉼라 20 G	Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일	851638035
30G 바늘	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9161502
Neubauer counting chamber	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	C-1003
Pattex Glue	Henkel AG & 공동, Dü 독일 셀도르프	PSK1C
LS column	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-401
림프구 분리 배지 (밀도 1,077 g/mL)	anprotec	AC-AF-0018
Papain	Merck	1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4	BioLegend, 샌디에이고, 미국	317428
PerCP/Cy5.5 마우스 IgG2b, κ isotype Ctrl	BioLegend, 샌디에이고, 미국	400337
PFA (파라포름알데히드)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	0335.1
Potassium hydrogen carbonate	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	P7481
혈청학적 피펫 10 mL	Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일	86.1254.001
주사기 1 mL	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9166017V
주사기 5 mL	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260067
주사기 20 mL	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260069
튜브 1.5 mL	Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일	72,706,400
튜브 2 mL	Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일	72.695.400
튜브 2mL, 갈색	Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일	72,695,001
튜브 15 mL	Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일	62.554.502
튜브 50 mL	Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일	62.547.254
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)	Bayer Vital GmbH, 레버쿠젠, 독일	KPOBD32