Summary

A pneumonectomia esquerda combinado com Monocrotaline ou Sugen como modelo de hipertensão pulmonar em ratos

Published: March 08, 2019
doi:

Summary

A roedor pneumonectomia esquerda é uma técnica valiosa na investigação de hipertensão pulmonar. Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o procedimento de pneumonectomia de rato e cuidados pós-operatórios para garantir mínima morbidade e mortalidade.

Abstract

Neste protocolo, detalhamos os passos processuais corretos e precauções necessárias para com êxito executar uma pneumonectomia esquerda e induzir PAH em ratos com a administração adicional de monocrotaline (MCT) ou SU5416 (Sugen). Podemos também comparar esses dois modelos para outros modelos PAH comumente utilizados na investigação. Nos últimos anos, o foco dos modelos animais PAH mudou-se para estudar o mecanismo de angioproliferation de lesões plexiforme, no qual o papel do fluxo sanguíneo pulmonar aumentado é considerado como um gatilho importante no desenvolvimento da severa pulmonar remodelação vascular. Um dos mais promissores modelos de roedores de hiperfluxo pulmonar é a pneumonectomia esquerda unilateral, combinada com um hit”segundo” do MCT ou Sugen. A remoção do pulmão esquerdo leva ao fluxo sanguíneo pulmonar aumentado e turbulento e remodelação vascular. Atualmente, não há nenhum procedimento detalhado da cirurgia pneumonectomia em ratos. Este artigo detalha um protocolo passo a passo do procedimento cirúrgico pneumonectomia e cuidados pós-operatórios em ratos Sprague Dawley masculinos. Resumidamente, o animal é anestesiado e o peito é aberto. Uma vez que a artéria pulmonar esquerda, veia pulmonar e brônquio são visualizados, eles são ligados e o pulmão esquerdo é removido. Em seguida, fechado no peito e o animal recuperado. O sangue é forçado a circular apenas no pulmão direito. Este aumento da pressão vascular leva a uma remodelação progressivo e oclusão de pequenas artérias pulmonares. O segundo hit do MCT ou Sugen é usado uma semana depois da cirurgia para induzir disfunção endotelial. A combinação do aumento do fluxo sanguíneo no pulmão e disfunção endotelial produz grave PAH. A principal limitação deste procedimento é que ele requer habilidades cirúrgicas gerais.

Introduction

Hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença progressiva e fatal, caracterizada por um aumento no fluxo sanguíneo pulmonar, aumento da resistência vascular, inflamação e remodelação de pequenos vasos sanguíneos pulmonares1. Esta remodelação geralmente resulta em lesões vasculares que obstruam e obliterar pequenas artérias pulmonares, causando vasoconstrição e aumento de pós-carga do ventrículo direito2. Existem alguns tratamentos farmacológicos bem sucedidos de PAH; Como consequência, restos de mortalidade PAH altas. Recentemente, o foco da pesquisa sobre a Patobiológico da hipertensão pulmonar mudou-se para um mecanismo de angio-proliferação, em que o papel do fluxo sanguíneo pulmonar aumentado é considerado como um gatilho importante no desenvolvimento da pulmonar vascular remodelação de3,4.

Modelos animais de hipertensão pulmonar forneceram introspecções críticas que ajudam a explicar a fisiopatologia da doença e têm servido como uma plataforma para a droga, celular, gene e entrega de proteína. Tradicionalmente, o modelo de hipertensão pulmonar induzida pela hipóxia crônica e o modelo de lesão pulmonar MCT têm sido os principais modelos utilizados para estudar PAH fisiopatologia5. No entanto, eles não são suficientes para produzir o padrão de fluxo e neointimal de sangue pulmonar aumentada de remodelação em relação às alterações descritas em pacientes humanos. O modelo de hipóxia crônica em roedores resulta em espessamento das paredes de vasos com vasoconstrição hipóxica sem angio-obliteração dos pequenos vasos pulmonares6. Além disso, a condição de hipóxia é reversível. Assim, o modelo de hipóxia não também é suficiente para produzir grave PAH. O modelo de lesão pulmonar MCT provocar alguma disfunção endotelial mas complexas vasculares obliterative lesões encontradas em humanos com HAP primária grave não desenvolvem no2ratos. Além disso, os ratos tratados com MCT tendem a morrer de toxicidade pulmonar induzida pelo MCT, doença hepática veno-oclusiva e miocardite em vez de PAH2. Finalmente, a pneumonectomia sozinha não é suficiente para produzir lesões neointimal em pequenos vasos pulmonares em um curto período de tempo. Depois a pneumonectomia, há mínima elevação na pressão arterial pulmonar7. Em humanos, a pneumonectomia é bem tolerada quando o pulmão contralateral é saudável7.

No entanto, o procedimento de pneumonectomia esquerda combinado com MCT ou Sugen é vantajoso uma vez que imita o fluxo sanguíneo pulmonar aumentado e resulta em remodelação vascular pulmonar comparável à Hap clínica grave. A pneumonectomia é executada no pulmão esquerdo, que tem apenas 1 lobo, em vez do direito, que possui quatro lóbulos. Se o pulmão direito foi removido, o animal seria incapaz de compensar a insuficiência respiratória. No modelo de pneumonectomia-MCT, neointimal padrão de remodelação desenvolve-se em mais de 90% dos animais operados tratados7. Da mesma forma, a combinação dos resultados Sugen e pneumonectomia em HAP grave, caracterizada por lesões vasculares angio-obliterative, proliferação, apoptose e RV disfunção8. O procedimento de pneumonectomia esquerda também é vantajoso em comparação com outros procedimentos cirúrgicos para induzir PAH. Anteriormente descritos modelos em ratos para aumentar o fluxo sanguíneo pulmonar para os pulmões incluem o aorto-caval shunt ou anastomose da artéria subclávia-pulmonar. Estes modelos são extremamente complicado7,9,10,11. Para realizar uma derivação aorto-caval, abdômen do animal tem que ser aberto. O shunt é colocado na aorta abdominal, que aumenta o fluxo sanguíneo para os órgãos abdominais em vez de apenas os pulmões, assim, PAH leva muito mais tempo para desenvolver. Além disso, é difícil determinar o fluxo de sangue através do shunt, Considerando que com a pneumonectomia, o sangue flui para as restantes duplas de pulmão. A anastomose da artéria subclávia-pulmonar também tem muitas complicações. O fluxo de sangue arterial na veia pode levar a trombose da anastomose e sangramento. Como a derivação aorto-caval, é difícil determinar o fluxo de sangue através da anastomose. Além disso, é uma técnica difícil e cara que requer habilidades cirúrgicas vasculares. A pneumonectomia esquerda unilateral duplica o fluxo sanguíneo e da tensão de cisalhamento no pulmão contralateral e, em combinação com MCT ou Sugen, faz com que os resultados típicos de hemodinâmicos e histopatológicos de PAH, que é a célula endotelial dano8, 12.

A novidade deste manuscrito é apresentada no protocolo cirúrgico muito detalhado e abrangente da pneumonectomia esquerda em ratos e na discussão dos desafios técnicos e fisiológicos destes modelos. Porque este protocolo não está atualmente disponível, muitos investigadores acreditam que o modelo é muito difícil usar. Os investigadores que tenham realizado a pneumonectomia esquerda têm enfrentado alta mortalidade e taxas de morbidade associadas com a perda desnecessária de animais, comprometendo a avaliação científica. Em vez disso, muitos vai usar modelos clássicos como MCT injeção, hipóxia crônica ou apenas a pneumonectomia criar PAH. No entanto, estes modelos são muito menos eficazes do que a combinação de MCT ou Sugen com a pneumonectomia esquerda. O objetivo principal deste artigo é fornecer o protocolo cirúrgico primeiro detalhado e reproduzível para a pneumonectomia esquerda unilateral em ratos e fornecer o melhor modelo cirúrgico de PAH. Combinar este protocolo para pneumonectomia unilateral à esquerda com MCT ou SU5416 permitirá que os investigadores criar um modelo muito mais eficaz e clinicamente relevante de grave PAH para estudar a patogênese desta doença fatal.

Protocol

Os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da faculdade de medicina da Icahn no Monte Sinai. Todos os ratos receberam atendimento humano em conformidade com o Monte Sinai “Guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório”. 1. preparação para a cirurgia Autoclave Cooley-Mayo curvo tesoura (grande tesoura), tesoura de íris reta (tesoura pequena), tesoura Iris McPherson-Vannas (tesoura de costas), f…

Representative Results

De acordo com o sistema de classificação aceites, hipertensão pulmonar caracteriza-se por uma pressão média de artéria pulmonar (PAPm) excedeu os limites superiores da pressão normal de artéria pulmonar (i.e., 25 mm Hg). No grupo MCT + pneumonectomia, grave PAH desenvolvido por dia 21, com um aumento PAPm (Figura 1). A PAPm é calculado pela fórmula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_uplo…

Discussion

Nos pulmões afetados PAH, proliferação vascular com formação neointimal e obliteração das artérias pulmonares resultar em graves alterações hemodinâmicas, insuficiência ventricular direita e precoce mortalidade7,8. As alterações às paredes do vaso aumentam a resistência ao fluxo sanguíneo, aumentando a pressão arterial e ventrículo direito. Nas fases iniciais de PAH, geralmente 3 semanas após a administração de MCT ou Sugen, ratos desenvolve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este manuscrito foi apoiado pelo NIH conceder 7R01 HL083078-10 concede a AHA American Heart Association-17SDG33370112 e o nacional institutos de saúde NIH K01 HL135474 de Y.S. e institutos nacionais de saúde R01 HL133554, de Sara

Materials

Surgical Blade Bard-Parker 371215 Incision
Forane (Isoflurane, USP) Baxter NDC 10019-360-40 anesthesia
BD Angiocath 16 G BD 381157 intubation tube, chest tube
BD 1 mL Insulin Syringe BD 329652 administer buprinex post-operatively
Biogel Surgeons Surgical Gloves Biogel 30460-01 sterile surgical gloves
Wahl BravMini+ Trimmer Braintree Scientific CLP-41590 P shave surgical site
SU5416 Cayman Chemical 13342 Sugen 
Fiber Optic Illuminator Cole-Parmer EW-41723-02 light for intubation
Surgipro II 4-0 Suture Covidien VP831X Closing intercostal muscles
Polysorb 5-0 Suture Covidien GL-885 Closing skin
Medium Slide Top Induction Chamber DRE Veterinary 12570 oxygen & isoflurane delivery
DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine DRE Veterinary 373 oxygen & isoflurane delivery
Small Vessel Cauterizer Kit Fine Science Tools 18000-00 cauterizer to minimize bleeding
VentElite Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 55-7040 ventilator
MouseSTAT Jr Kent Scientific MSTAT-JR pulse oximeter & heart rate monitor
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor Kent Scientific SPO2-MSE pulse oximeter & heart rate paw sensor
PhysioSuite RightTemp Kent Scientific PS-02 temperature pad
PVP Prep Solution Medline MDS093944 Cleaning surgical site
Poly-lined Drape Medline NON21002Z cover animal
3 mL syringe Medline SYR103010 administer fluids post-operatively
Microsurgical Kits, Integra  Miltex 95042-540 surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors
Hemostatic forceps – Micro-Jacobson-Mosquito Miltex 17-2602 mosquito
Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NDC 42023-179-01 Pain relief
Cooley-Mayo curved scissors Pilling 352090 Large scissors
Gerald Tissue forceps Pilling 351900 forceps
Wangesnsteen Tissue Forceps Pilling 342929 atraumatic forceps
Pilling Thin Vascular Needle Holder Pilling 354962DG needle holder
Crotaline Sigma-Aldrich C2401-1G MCT
Surflash 20 G IV Catheter Terumo SR*FF2051 For pressure reading during organ harvest
ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter Transonic Inc ADV500 Record pulmonary artery and right ventricle pressure
Medium Hemoclip Weck 523700 ligate vessels
Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved Weck Horizon 237081 hemoclip applicator
Surgical Microscope Zeiss OPMI MD 1808 magnification

References

  1. Leopold, J., Maron, B. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 761 (2016).
  2. Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L363-L369 (2012).
  3. van Albada, M. E., et al. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. European Respiratory Journal. 26 (3), 487-493 (2005).
  4. Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A. J., Berger, R. M. F. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: lessons from preclinical animal models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (1), L1-L14 (2013).
  5. Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
  6. Cahill, E., et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally. Experimental Physiology. 97 (6), 796-806 (2012).
  7. Okada, K., et al. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. American Journal of Pathology. 151 (4), 1019-1025 (1997).
  8. Happé, C. M., et al. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
  9. Tanaka, Y., Schuster, D. P., Davis, E. C., Patterson, G. A., Botney, M. D. The role of vascular injury and hemodynamics in rat pulmonary artery remodeling. Journal of Clinical Investigation. 98 (2), 434-442 (1996).
  10. Nishimura, T., Faul, J. L., Berry, G. J., Kao, P. N., Pearl, R. G. Effect of a surgical aortocaval fistula on monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Critical Care Medicine. 31 (4), 1213-1218 (2003).
  11. Linardi, D., et al. Ventricular and pulmonary vascular remodeling induced by pulmonary overflow in a chronic model of pretricuspid shunt. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (6), 2609-2617 (2014).
  12. White, R. J., et al. Plexiform-like lesions and increased tissue factor expression in a rat model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L583-L590 (2007).
  13. Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (3), 572-587 (2017).
check_url/kr/59050?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Katz, M. G., Fargnoli, A. S., Gubara, S. M., Bisserier, M., Sassi, Y., Bridges, C. R., Hajjar, R. J., Hadri, L. The Left Pneumonectomy Combined with Monocrotaline or Sugen as a Model of Pulmonary Hypertension in Rats. J. Vis. Exp. (145), e59050, doi:10.3791/59050 (2019).

View Video