La neumonectomía izquierda combinado con Monocrotaline o Sugen como un modelo de hipertensión pulmonar en ratas
Summary
La neumonectomía izquierda roedor es una técnica valiosa en la investigación de la hipertensión pulmonar. Aquí, presentamos un protocolo para describir el procedimiento de Neumonectomía de rata y cuidado postoperatorio para mortalidad y morbilidad mínima.
Abstract
En este protocolo, detallamos el procedimiento correcto y las precauciones necesarias para realizar una Neumonectomía izquierda y PAH de inducir en las ratas con la administración adicional de monocrotaline (MCT) con éxito o SU5416 (Sugen). También comparamos estos dos modelos a otros modelos PAH usados en la investigación. En los últimos años, el enfoque de modelos animales de la PAH ha avanzado hacia el estudiar el mecanismo de angioproliferation de las lesiones plexiformes, en el que el papel del flujo de sangre pulmonar creciente es considerado como un disparador importante en el desarrollo de severa pulmonar remodelado vascular. Uno de los modelos de roedores más prometedoras de aumento del flujo pulmonar es el unilateral Neumonectomía izquierda combinado con un “segundo golpe” de MCT o Sugen. La eliminación del pulmón izquierdo conduce al flujo sanguíneo pulmonar creciente y turbulento y remodelado vascular. Actualmente, no hay ningún procedimiento detallado de la cirugía de Neumonectomía en ratas. Este artículo detalla un protocolo paso a paso del procedimiento quirúrgico de Neumonectomía y cuidados postoperatorios en ratas Sprague-Dawley macho. Brevemente, el animal está anestesiado y el pecho se abre. Una vez que se visualizaron la arteria pulmonar izquierda, la vena pulmonar y el bronquio, se unen y se extrae el pulmón izquierdo. Luego cerró el pecho y el animal se recuperó. Sangre es forzada a circular sólo en el pulmón derecho. Este aumento de la presión vascular conduce a una progresiva remodelación y oclusión de pequeñas arterias pulmonares. El segundo golpe de MCT o Sugen es usada una semana después de la cirugía para inducir disfunción endotelial. La combinación de aumento del flujo sanguíneo en el pulmón y la disfunción endotelial produce HAP severa. La principal limitación de este procedimiento es que requiere habilidades quirúrgicas generales.
Introduction
Hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad progresiva y fatal caracterizada por un aumento de flujo sanguíneo pulmonar, aumento de la resistencia vascular, inflamación y remodelación de los vasos sanguíneos pulmonares pequeños1. Esta remodelación usualmente resulta en lesiones vasculares que obstruyen y borrar pequeñas arterias pulmonares, causando vasoconstricción y aumento de la poscarga del ventrículo derecho2. Existen algunos tratamientos farmacológicos Exitos de PAH; como consecuencia, restos de PAH la mortalidad alta. Recientemente, el foco de investigación en Patobiología de la hipertensión pulmonar se ha movido hacia un mecanismo en el que el papel del flujo de sangre pulmonar creciente es considerado como un disparador importante en el desarrollo de pulmonar vascular angio-proliferación remodelación de3,4.
Modelos animales de hipertensión pulmonar han proporcionado penetraciones críticas que ayudan a explicar la fisiopatología de la enfermedad y han servido como una plataforma para drogas, celulares, gene y proteína entrega. Tradicionalmente, el modelo de hipertensión pulmonar inducida por hipoxia crónica y el modelo de lesión de pulmón MCT han sido los principales modelos utilizados para el estudio de la patofisiología PAH5. Sin embargo, no son suficientes para producir el patrón creciente de la sangre pulmonar flujo y neointimal de remodelación frente a las alteraciones descritas en pacientes humanos. El modelo de hipoxia crónica en roedores produce engrosamiento de las paredes del recipiente con la vasoconstricción hipóxica sin angio-obliteración de los vasos pulmonares pequeños6. Además, la condición de hipoxia es reversible. Así, el modelo de hipoxia también no es suficiente para producir HAP severa. El modelo de lesión pulmonar MCT provocar alguna disfunción endotelial pero el complejo obliterativa las lesiones vasculares encontradas los seres humanos con HAP primaria severa no se convierten en ratas2. Además, las ratas tratadas con MCT tienden a morir de la toxicidad pulmonar inducida por el MCT, Enfermedad veno-oclusiva del hígado y miocarditis en lugar de PAH2. Finalmente, la neumonectomía sola no es suficiente para producir lesiones neointimal en los pequeños vasos pulmonares en un período corto de tiempo. Después de la Neumonectomía, hay mínima elevación en la presión arterial pulmonar7. En los seres humanos, la neumonectomía es bien tolerada cuando el pulmón contralateral es sano7.
Sin embargo, el procedimiento de Neumonectomía izquierda combinado con MCT o Sugen es ventajoso ya que imita el flujo de sangre pulmonar creciente y resultados en la remodelación vascular pulmonar comparable a PAH clínica severa. La neumonectomía se realiza en el pulmón izquierdo, que tiene sólo 1 lóbulo, en lugar de a la derecha, que tiene cuatro lóbulos. Si le extirparon el pulmón derecho, el animal sería incapaz de compensar la insuficiencia respiratoria. En el modelo de Neumonectomía-MCT, neointimal patrón de remodelación se convierte en más del 90% de animales operados tratados7. Del mismo modo, la combinación de resultados Sugen y Neumonectomía en HAP severa, caracterizada por lesiones vasculares angio-obliterativa, proliferación, apoptosis y RV disfunción8. El procedimiento de Neumonectomía izquierda también es ventajoso en comparación con otros procedimientos quirúrgicos para inducir la PAH. Previamente descritos modelos en ratas para aumentar el flujo sanguíneo pulmonar a los pulmones incluyen la derivación aortocaval o anastomosis de arteria subclavia-pulmonar. Estos modelos son extremadamente complicado7,9,10,11. Para realizar una derivación aorto-caval, abdomen del animal tiene que ser abierto. La derivación se coloca en la aorta abdominal, que aumenta el flujo sanguíneo a todos los órganos abdominales en lugar de a los pulmones, por lo tanto, toma mucho más tiempo para desarrollar HAP. Además, es difícil determinar el flujo de sangre a través de la desviación, mientras que con la neumonectomía la sangre fluir a los dobles de pulmón restante. La anastomosis de la arteria subclavia-pulmonar también tiene muchas complicaciones. El flujo de sangre arterial en la vena puede llevar a la trombosis de la anastomosis y sangrado. Como la desviación aorto-caval, es difícil determinar el flujo de sangre a través de la anastomosis. Además, es una técnica costosa y difícil que requiere de habilidades quirúrgicas vasculares. La neumonectomía izquierda unilateral duplica el flujo sanguíneo y la tensión de esquileo en el pulmón contralateral y, en combinación con MCT o Sugen, provoca los resultados hemodinámicos e histopatológicos típicos de PAH que es la célula endotelial daño8, 12.
La novedad de este manuscrito se presenta en el protocolo quirúrgico muy detallado y completo de la neumonectomía izquierda en ratas y en la discusión de los desafíos técnicos y fisiológicos de estos modelos. Ya que este Protocolo no está disponible actualmente, muchos investigadores creen que el modelo es demasiado difícil. Los investigadores que han realizado la neumonectomía izquierda enfrentan alta tasas de mortalidad y morbilidad asociadas a la pérdida innecesaria de animales, comprometer la evaluación científica. En cambio, muchos utilizan modelos clásicos como inyección de MCT, hipoxia crónica o a la neumonectomía para crear PAH. Sin embargo, estos modelos son mucho menos eficaces que la combinación de MCT o Sugen con la neumonectomía izquierda. El propósito principal de este artículo es proporcionar el protocolo quirúrgico primero detallado y reproducible para la neumonectomía izquierda unilateral en ratas y proporcionar el mejor modelo quirúrgico de PAH. Combinar este protocolo para Neumonectomía unilateral izquierda con MCT o SU5416 permitirá a los investigadores a crear un modelo mucho más eficaz y clínicamente relevante de HAP severa para el estudio de la patogenia de esta enfermedad fatal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En pulmones afectados de PAH, proliferación vascular con formación neointimal y obliteración de las arterias pulmonares resultan en cambios hemodinámicos severos, insuficiencia ventricular derecha y temprana mortalidad7,8. Los cambios en las paredes del recipiente aumentan resistencia al flujo sanguíneo, aumento de la presión arterial y ventricular derecha. En las primeras etapas de la PAH, generalmente 3 semanas después de la administración de MCT o Suge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito fue apoyado por los NIH grant 7R01 HL083078-10 becas de la Asociación Americana del corazón AHA-17SDG33370112 y de los institutos nacionales de salud NIH K01 HL135474 a Y.S. y de los institutos nacionales de salud R01 HL133554 a izquierda
Materials
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps – Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
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