Beskrevet her er en metode til at analysere bakteriel genekspression i animalsk væv på et cellulært niveau. Denne metode giver en ressource for at studere fænotypiske mangfoldigheden indtræffer inden for en bakteriel befolkning i svar til væv miljø under en infektion.
Bakteriel virulens gener er ofte reguleret på transkriptionel niveau af flere faktorer, der reagerer på forskellige miljømæssige signaler. Nogle faktorer handle direkte på virulens gener; andre styre patogenesen ved at justere udtryk for downstream tilsynsmyndigheder eller ophobning af signaler, der påvirker regulator aktivitet. Mens forordningen er blevet undersøgt udførligt under in vitro- vækst, er relativt lidt kendt om hvordan genekspression reguleres under infektion. Sådanne oplysninger er vigtige, når et bestemt gen produkt er en kandidat til terapeutisk intervention. Transkriptionel tilgange som kvantitative, real-time RT-PCR og RNA-Seq er effektive måder at undersøge Gen-ekspression på globalt plan, men lider af mange tekniske udfordringer, herunder lav overflod af bakterielle RNA sammenlignet med værten RNA, og prøven nedbrydning af RNases. Evaluering af forordningen ved hjælp af fluorescerende journalister er relativt let og kan være multipleksede med fluorescerende proteiner med unikke spektrale egenskaber. Metoden giver mulighed for enkelt-celle, spatiotemporelle analyse af genekspression i væv, der udviser komplekse tredimensionale arkitektur og lægemiddels gradienter, der påvirker bakteriel regulerende net. Sådanne oplysninger går tabt, når data er gennemsnit over befolkningens bulk. Heri, beskriver vi en metode til kvantificering af genekspression i bakterielle patogener in situ. Metoden er baseret på enkle væv forarbejdning og direkte observation af fluorescens fra reporter proteiner. Vi påvise nytten af dette system ved at undersøge udtryk for Staphylococcus aureus thermonuclease (NUK), hvis genet produkt er nødvendig for immun unddragelse og fuld virulens ex vivo og in vivo. Vi viser at nuc-normal god landbrugspraksis er stærkt udtrykt i nyre bylder og afsløre heterogene genekspression skyldes delvis tilsyneladende rumlige regulering af nuc promotor aktivitet i bylder fuldt engageret med immunrespons. Metoden kan anvendes på enhver bakterie med et manipulatable genetiske system og enhver infektion model, at give værdifulde oplysninger til prækliniske undersøgelser og udvikling af lægemidler.
Bakterier reagere på ændrede fysiologiske forhold og ændringer i deres miljø ernæringsmæssige tilstand af varierende udtrykker gener kræves for tilpasning og overlevelse. For eksempel, kolonisere opportunistiske patogener krop overflader på relativt lav tæthed, og er ofte uskadelig. Men når bakterien har trængt fysiske og kemiske barrierer, skal det slås med værten immun celle Counter forsvar og kun næringsstoftilgængelighed1. Som et eksempel, Staphylococcus aureus koloniserer ca. en tredjedel af befolkningen asymptomatically, men er også årsag til ødelæggende hud og bløddele infektioner, osteomyelitis, endocarditis og bakteriæmi2. Succesen med S. aureus som en patogen ofte tillægges dets metaboliske fleksibilitet samt et arsenal af overflade-associerede og udskilles virulens faktorer, der aktiverer bakterie kan slippe ud i blodbanen og replikere i perifert væv 3,4,5. Da værten dødsfald som følge af stafylokok sygdom er en evolutionær blindgyde og grænser transmission til nye værter6, skal forpligtelse til virulens faktor produktion kontrolleres omhyggeligt.
En komplekse regulerende netværk af proteiner og ikke-kodende RNA’er svarer til en lang række miljømæssige stimuli, herunder celle tæthed, vækstfase, neutrofile-associerede faktorer og næringsstoftilgængelighed, at sikre at virulens gener er udtrykt ved den præcise tidspunkt og sted inden for værten væv7,8,9,10,11,12,13. For eksempel, regulerer SaeR/S to komponent system (TCS) udtryk for flere virulens faktorer via sensor kinase (SLV) og svar regulator (SaeR)14. SLV er autophosphorylated på en bevaret histidin rester i svar til værten signaler (f.eks., menneskelige neutrofile peptider [HNPs], calprotectin)8,15,16. Gruppen phosphoryl overføres derefter til en aspartat rester på SaeR, aktivere det som en DNA-bindende protein (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS regulerer over 20 gener, at bidrager til patogenesen herunder fibronektin bindende proteiner (FnBPs), leukocidins og coagulase14,18,19,20. Mål kan inddeles i høj-affinitet og lav-affinitet gen mål, som sandsynligvis induceret som niveauet for SaeR ~ P stiger når de udsættes for dens stikord21. SaeR/S aktivitet er kontrolleret af andre regulatorer af genekspression såsom Agr quorum sensing system, repressor toksiner protein (Rot), og alternative sigma faktor B (SigB)22,23,24.
NUK er en Sae-afhængige virulens gen i Staphylococcus aureus og koder thermonuclease (NUK), som er afgørende for flygter fra neutrophilic extracellular trapper (net) og formidling under den løbet af infektion25,26. Udtryk for NUK er også stærkt indirekte undertrykt af CodY forgrenede aminosyrer og GTP27, og direkte undertrykt af stafylokokker tilbehør regulator protein SarA28,29 , hvis aktiviteter er påvirket af ilt (redox stat) og pH30. I betragtning af at sæ og nuc mutanter er svækket i musemodeller af infektion, er der interesse i at udvikle kemiske interventioner, der hæmmer deres tilsvarende aktiviteter26,31. Trods dette er der ingen oplysninger om deres forordning under infektion.
Fluorescerende journalister har været brugt til at overvåge og kvantificere genekspression på enkelt celle-niveau. Heri, præsenterer vi en metode til kvantificering af S. aureus genekspression under infektion, når parret med in vitro-transkriptom analyse og kraftfulde Billeddannende teknikker som magnetisk resonans imaging (MR) og magnetisk resonans-spektroskopi (MRS), kan afsløre hvordan bakteriel fysiologi er reguleret i vivo og de relative mængder af næringsstoffer i visse nicher. Metoden kan anvendes på enhver bakteriel patogen med en tractable genetiske system.
Oversigt over genom Integrativ vektor.
Genom Integrativ vektor pRB4 indeholder 500 basepar hver fra de opstrøms og nedstrøms regioner af S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene lette homologe rekombination. pRB4 er afledt af den temperatur-følsomme pMAD vektor rygraden indeholdende erythromycin modstand kassette (ermC) og termostabil beta-galactosidase gen bgaB for blå/hvid screening af recombinants32. Manipuleret reporter konstruktion indeholder også en chloramphenicol modstand markør (kat) for udvælgelse efter genom integration og plasmid elimination, samt EcoRI og SmaI steder at sammensmelte de regulerende region af interesse for superfolder grøn fluorescerende proteiner (sGFP) (figur 1). Det er kendt, at valget af ribosomet bindingssted (RBS) påvirker aktiviteten af journalisten, og ofte kræver empiriske optimering33. En RBS leveres således ikke. Her, native ribosomet bindingssted bruges til at give en mere naturlig mønster af genekspression, men andre websteder kan anvendes.
Bakteriel smitsomme sygdomme er et stigende sundhedsproblem over hele verden på grund af erhvervelse af antibiotikaresistens determinanter46. Fordi tilpasning til værtsmiljøer er afgørende for vækst og overlevelse under infektion, strategier rettet mod gen udtryk programmer, der øger patogen fitness kan vise sig nyttige terapeutisk. Et sådant program er sæt af gener kontrolleret af SaeR/S to komponent system (TCS), vist tidligere at spille en afgørende rolle i immunforsvaret unddragelse<s…
The authors have nothing to disclose.
Vi takke Alexander Horswill til PsarAP1– tdTomato fusion, og Karen Creswell gave til hjælp med flow flowcytometri analyse. Vi takker også Alyssa King for rådgivning om statistisk analyse. Dette arbejde var delvis finansieret af en NIH sonderende/udviklingsmæssige Research Award (grant AI123708) og Fakultet start midler til SRB. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og fortolkning eller beslutningen om at sende arbejdet for publikation.
5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
glass beads | Sigma | Z273627 | |
Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
PCR purification | QIagen | 28106 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
Plate reader | Tecan | NA | |
Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |