JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
유전학

Et fluorescens-baseret metode til at studere bakteriel RIBOREGULATION i smittet væv

Published: February 19, 2019
doi:
10.3791/59055
, , ,
1Department of Biology,Georgetown University

Summary

Beskrevet her er en metode til at analysere bakteriel genekspression i animalsk væv på et cellulært niveau. Denne metode giver en ressource for at studere fænotypiske mangfoldigheden indtræffer inden for en bakteriel befolkning i svar til væv miljø under en infektion.

Abstract

Bakteriel virulens gener er ofte reguleret på transkriptionel niveau af flere faktorer, der reagerer på forskellige miljømæssige signaler. Nogle faktorer handle direkte på virulens gener; andre styre patogenesen ved at justere udtryk for downstream tilsynsmyndigheder eller ophobning af signaler, der påvirker regulator aktivitet. Mens forordningen er blevet undersøgt udførligt under in vitro- vækst, er relativt lidt kendt om hvordan genekspression reguleres under infektion. Sådanne oplysninger er vigtige, når et bestemt gen produkt er en kandidat til terapeutisk intervention. Transkriptionel tilgange som kvantitative, real-time RT-PCR og RNA-Seq er effektive måder at undersøge Gen-ekspression på globalt plan, men lider af mange tekniske udfordringer, herunder lav overflod af bakterielle RNA sammenlignet med værten RNA, og prøven nedbrydning af RNases. Evaluering af forordningen ved hjælp af fluorescerende journalister er relativt let og kan være multipleksede med fluorescerende proteiner med unikke spektrale egenskaber. Metoden giver mulighed for enkelt-celle, spatiotemporelle analyse af genekspression i væv, der udviser komplekse tredimensionale arkitektur og lægemiddels gradienter, der påvirker bakteriel regulerende net. Sådanne oplysninger går tabt, når data er gennemsnit over befolkningens bulk. Heri, beskriver vi en metode til kvantificering af genekspression i bakterielle patogener in situ. Metoden er baseret på enkle væv forarbejdning og direkte observation af fluorescens fra reporter proteiner. Vi påvise nytten af dette system ved at undersøge udtryk for Staphylococcus aureus thermonuclease (NUK), hvis genet produkt er nødvendig for immun unddragelse og fuld virulens ex vivo og in vivo. Vi viser at nuc-normal god landbrugspraksis er stærkt udtrykt i nyre bylder og afsløre heterogene genekspression skyldes delvis tilsyneladende rumlige regulering af nuc promotor aktivitet i bylder fuldt engageret med immunrespons. Metoden kan anvendes på enhver bakterie med et manipulatable genetiske system og enhver infektion model, at give værdifulde oplysninger til prækliniske undersøgelser og udvikling af lægemidler.

Introduction

Bakterier reagere på ændrede fysiologiske forhold og ændringer i deres miljø ernæringsmæssige tilstand af varierende udtrykker gener kræves for tilpasning og overlevelse. For eksempel, kolonisere opportunistiske patogener krop overflader på relativt lav tæthed, og er ofte uskadelig. Men når bakterien har trængt fysiske og kemiske barrierer, skal det slås med værten immun celle Counter forsvar og kun næringsstoftilgængelighed1. Som et eksempel, Staphylococcus aureus koloniserer ca. en tredjedel af befolkningen asymptomatically, men er også årsag til ødelæggende hud og bløddele infektioner, osteomyelitis, endocarditis og bakteriæmi2. Succesen med S. aureus som en patogen ofte tillægges dets metaboliske fleksibilitet samt et arsenal af overflade-associerede og udskilles virulens faktorer, der aktiverer bakterie kan slippe ud i blodbanen og replikere i perifert væv 3,4,5. Da værten dødsfald som følge af stafylokok sygdom er en evolutionær blindgyde og grænser transmission til nye værter6, skal forpligtelse til virulens faktor produktion kontrolleres omhyggeligt.

En komplekse regulerende netværk af proteiner og ikke-kodende RNA’er svarer til en lang række miljømæssige stimuli, herunder celle tæthed, vækstfase, neutrofile-associerede faktorer og næringsstoftilgængelighed, at sikre at virulens gener er udtrykt ved den præcise tidspunkt og sted inden for værten væv7,8,9,10,11,12,13. For eksempel, regulerer SaeR/S to komponent system (TCS) udtryk for flere virulens faktorer via sensor kinase (SLV) og svar regulator (SaeR)14. SLV er autophosphorylated på en bevaret histidin rester i svar til værten signaler (f.eks., menneskelige neutrofile peptider [HNPs], calprotectin)8,15,16. Gruppen phosphoryl overføres derefter til en aspartat rester på SaeR, aktivere det som en DNA-bindende protein (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS regulerer over 20 gener, at bidrager til patogenesen herunder fibronektin bindende proteiner (FnBPs), leukocidins og coagulase14,18,19,20. Mål kan inddeles i høj-affinitet og lav-affinitet gen mål, som sandsynligvis induceret som niveauet for SaeR ~ P stiger når de udsættes for dens stikord21. SaeR/S aktivitet er kontrolleret af andre regulatorer af genekspression såsom Agr quorum sensing system, repressor toksiner protein (Rot), og alternative sigma faktor B (SigB)22,23,24.

NUK er en Sae-afhængige virulens gen i Staphylococcus aureus og koder thermonuclease (NUK), som er afgørende for flygter fra neutrophilic extracellular trapper (net) og formidling under den løbet af infektion25,26. Udtryk for NUK er også stærkt indirekte undertrykt af CodY forgrenede aminosyrer og GTP27, og direkte undertrykt af stafylokokker tilbehør regulator protein SarA28,29 , hvis aktiviteter er påvirket af ilt (redox stat) og pH30. I betragtning af at sæ og nuc mutanter er svækket i musemodeller af infektion, er der interesse i at udvikle kemiske interventioner, der hæmmer deres tilsvarende aktiviteter26,31. Trods dette er der ingen oplysninger om deres forordning under infektion.

Fluorescerende journalister har været brugt til at overvåge og kvantificere genekspression på enkelt celle-niveau. Heri, præsenterer vi en metode til kvantificering af S. aureus genekspression under infektion, når parret med in vitro-transkriptom analyse og kraftfulde Billeddannende teknikker som magnetisk resonans imaging (MR) og magnetisk resonans-spektroskopi (MRS), kan afsløre hvordan bakteriel fysiologi er reguleret i vivo og de relative mængder af næringsstoffer i visse nicher. Metoden kan anvendes på enhver bakteriel patogen med en tractable genetiske system.

Oversigt over genom Integrativ vektor.

Genom Integrativ vektor pRB4 indeholder 500 basepar hver fra de opstrøms og nedstrøms regioner af S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene lette homologe rekombination. pRB4 er afledt af den temperatur-følsomme pMAD vektor rygraden indeholdende erythromycin modstand kassette (ermC) og termostabil beta-galactosidase gen bgaB for blå/hvid screening af recombinants32. Manipuleret reporter konstruktion indeholder også en chloramphenicol modstand markør (kat) for udvælgelse efter genom integration og plasmid elimination, samt EcoRI og SmaI steder at sammensmelte de regulerende region af interesse for superfolder grøn fluorescerende proteiner (sGFP) (figur 1). Det er kendt, at valget af ribosomet bindingssted (RBS) påvirker aktiviteten af journalisten, og ofte kræver empiriske optimering33. En RBS leveres således ikke. Her, native ribosomet bindingssted bruges til at give en mere naturlig mønster af genekspression, men andre websteder kan anvendes.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Georgetown University. 1. generation af fluorescerende Reporter stamme Fordøje genom Integrativ pRB4 vektor sekventielt med EcoRI og SmaI-restriktionsenzymer. Efter fabrikantens protokol, oprette en overnight fordøjelse med SmaI ved hjælp af 1 µg for pRB4 ved 25 ° C, og derefter fortsætte med den anden fordøjelse i 1 timer ved 37 ° C ved at føje EcoRI til reaktionsblandinge…

Representative Results

Vi udviklede et plasmid, afledt af pMAD32 , der kan levere en reporter fusion konstruktion i kromosom af dobbelt crossover homologe rekombination (figur 1). Denne konstruktion giver mulighed for kvantitativ analyse af enhver regulerende region, der understøtter produktionen af normal god landbrugspraksis protein og fluorescerende signal over baggrunden. Plasmidet giver ampicillin-resistens (Apr) for vedligeholdelse og forme…

Discussion

Bakteriel smitsomme sygdomme er et stigende sundhedsproblem over hele verden på grund af erhvervelse af antibiotikaresistens determinanter46. Fordi tilpasning til værtsmiljøer er afgørende for vækst og overlevelse under infektion, strategier rettet mod gen udtryk programmer, der øger patogen fitness kan vise sig nyttige terapeutisk. Et sådant program er sæt af gener kontrolleret af SaeR/S to komponent system (TCS), vist tidligere at spille en afgørende rolle i immunforsvaret unddragelse<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takke Alexander Horswill til PsarAP1– tdTomato fusion, og Karen Creswell gave til hjælp med flow flowcytometri analyse. Vi takker også Alyssa King for rådgivning om statistisk analyse. Dette arbejde var delvis finansieret af en NIH sonderende/udviklingsmæssige Research Award (grant AI123708) og Fakultet start midler til SRB. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og fortolkning eller beslutningen om at sende arbejdet for publikation.

Materials

5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Tags

Bacterial Gene RegulationFluorescence-based MethodBacterial Gene ExpressionS. AureusHemolytic PhenotypeBacterial PhysiologyAntivirulenceAntibacterial CompoundsCryosectioningDAPI Staining
check_url/kr/59055?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image