Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Summary

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Abstract

Bakteriellen Virulenz Gene sind oft auf transkriptioneller Ebene durch mehrere Faktoren reguliert, die auf verschiedenen Umweltsignale reagieren. Einige Faktoren wirken direkt auf die Virulenz Gene; andere Steuern Pathogenese durch Anpassung der Ausdruck der nachgeschalteten Regulierungsbehörden oder die Ansammlung von Signalen, die Regler beeinflussen. Während Verordnung ausgiebig während des Wachstums in Vitro untersucht wurde, ist, relativ wenig bekannt über wie Genexpression während der Infektion angepasst wird. Solche Informationen sind wichtig, wenn ein bestimmtes Gen-Produkt ein Kandidat für eine therapeutische Intervention ist. Transkriptionelle Ansätze wie quantitative, Real-Time RT-PCR und RNA-Seq sind leistungsfähige Möglichkeiten zur Genexpression auf globaler Ebene zu untersuchen, aber leiden viele technische Herausforderungen einschließlich niedrige Fülle von bakteriellen RNA im Vergleich zu Host RNA und Probe Abbau durch RNases. Bewertung der Verordnung mit fluoreszierenden Reporter ist relativ einfach und kann mit fluoreszierenden Proteinen mit einzigartigen spektralen Eigenschaften gemultiplext werden. Die Methode ermöglicht für einzellige, räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression in Geweben, die komplexe dreidimensionale Architektur und physiochemische Gradienten aufweisen, die bakterielle Regulationsnetzwerke beeinflussen. Diese Information geht verloren, wenn Daten über die Masse Bevölkerung gemittelt werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Genexpression in bakterielle Krankheitserreger in Situ. Die Methode basiert auf einfachen Gewebe Verarbeitung und direkte Beobachtung der Fluoreszenz von Reporter Proteine. Wir zeigen den Nutzen dieses System durch die Untersuchung des Ausdrucks von Staphylococcus Aureus Thermonuclease (Nuc), dessen Genprodukt für immun ausweichen und volle Virulenz ex-Vivo- und in-vivo benötigt wird. Wir zeigen, dass Nuc-Gfp äußert sich stark in renalen Abszessen und offenbaren heterogene Genexpression durch teilweise deutlich räumlicher Regulierung der Nuc Promotoraktivität in Abszessen engagiert mit der Immunantwort. Die Methode kann auf jedes Bakterium mit einem manipulierbar genetische System und jede Infektionsmodell, Bereitstellung von wertvollen Informationen für präklinische Studien und Entwicklung von Medikamenten angewendet werden.

Introduction

Bakterien reagieren auf veränderte physiologische Bedingungen und Veränderungen in der Ernährungszustand ihres Umfeldes differentiell zum Ausdruck bringen, Gene, die für Anpassung und das Überleben erforderlichen. Zum Beispiel besiedeln opportunistische Krankheitserreger Körper Oberflächen bei relativ geringer Dichte und sind oft harmlos. Jedoch sobald das Bakterium physikalische und chemische Barrieren eingedrungen ist, muss es mit Host Immunzelle Counter Abwehrkräfte und eingeschränkte Nährstoffverfügbarkeit¹zu kämpfen. Als Beispiel Staphylococcus Aureus kolonisiert ungefähr ein Drittel der Bevölkerung asymptomatisch aber ist auch die Ursache des verheerenden Haut und Weichteilinfektionen, Osteomyelitis, Endokarditis und Bakteriämie². Der Erfolg von S. Aureus als ein Pathogen ist oft seine metabolischen Flexibilität sowie ein ganzes Arsenal an Oberfläche verbunden und sekretierten Virulenzfaktoren, die es das Bakterium ermöglichen zu den Blutkreislauf zu entkommen und zu replizieren in peripheren Geweben ^{zugeschrieben 3,4,5}. Da Host Tod durch Staphylokokken Krankheit eine evolutionäre Sackgasse und Grenzen Übertragung auf neue Gastgeber⁶ist, muss die Verpflichtung zur Virulenz Faktor Produktion sorgfältig kontrolliert werden.

Einem komplexen regulatorischen Netzwerk von Proteinen und nicht-kodierende RNAs reagiert auf vielfältige Reize aus der Umwelt, einschließlich der Zelle Dichte, Wachstumsphase, Neutrophilen-assoziierte Faktoren und Nährstoffverfügbarkeit, um sicherzustellen, dass die Virulenz Gene exprimiert werden, bei der genaue Zeit und Ort im Host Gewebe^{7,8,9,10,11,12,13}. Beispielsweise regelt das SaeR/S zwei-Komponentensystem (TCS) Ausdruck von mehreren Virulenzfaktoren über die Sensor-Kinase (SaeS) und der Reaktion Regler (SaeR)¹⁴. SaeS ist Autophosphorylated auf einen konservierten Histidin Überrest in Reaktion auf Host Signale (z.B., menschlichen Neutrophilen Peptide [HNPs], Calprotectin)^8,15,16. Die Phosphoryl-Gruppe wird dann ein Aspartat-Rückstand auf SaeR, aktivieren es als ein DNA-bindendes Protein übertragen (SaeR ~ P)¹⁷. Die SaeR/S TCS regelt über 20 Gene, die zur Pathogenese einschließlich Fibronektin-bindende Proteine (FnBPs), Leukocidins und Coagulase^14,18,19,20beitragen. Ziele lassen sich einteilen in hohe Affinität und niedrige Affinität gen Ziele, die geeignet sind, als das Niveau der SaeR induzierte ~ P steigt, wenn die Hinweise²¹ausgesetzt. Die SaeR/S-Aktivität erfolgt durch andere Regulatoren der Genexpression wie die Agr-Quorum-sensing-System, Repressor der Toxine Protein (Rot) und die alternative Sigma-Faktor B (SigB)^22,23,24.

NUC ein Sae-abhängige Virulenz gen in Staphylococcus Aureus und kodiert Thermonuclease (Nuc), die wesentlich für die Flucht aus nEutrophilic eXtracellular tRaps (Netze) und für die Verbreitung während der Verlauf der Infektion^25,26. Der Ausdruck der Nuc ist indirekt auch stark unterdrückt von CodY in Anwesenheit von verzweigtkettigen Aminosäuren und GTP²⁷und direkt unterdrückt durch die Staphylokokken Zubehör Regler Protein SarA^28,29 , deren Aktivität wird durch Sauerstoff (Redox-Zustand) und pH³⁰beeinflusst. Angesichts der Tatsache, dass Sae und Nuc Mutanten in Mausmodellen der Infektion abgeschwächt werden, gibt es Interesse an der Entwicklung von chemischen Interventionen, die ihre entsprechende Aktivitäten^26,31zu hemmen. Trotzdem gibt es keine Informationen über ihre Regulierung während der Infektion.

Fluoreszierende Reporter wurden zur Überwachung und Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle zu quantifizieren. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Quantifizierung der S. Aureus Genexpression während der Infektion, wenn gepaart mit in-vitro-Transkriptom-Analyse und leistungsstarke bildgebende Verfahren wie Magnetresonanztomographie (MRT) und Magnetresonanz-Spektroskopie (MRS), können zeigen, wie bakterielle Physiologie ist in Vivo und die relativen Häufigkeiten von Nährstoffen in bestimmten Nischen geregelt. Die Methode kann für jede bakterielle Erreger mit einem gefügig genetische System angewendet werden.

Übersicht über das Genom integrative Vektor.

Die Genom-integrative Vektor-pRB4 enthält 500 niedrige Paare aus den vor- und nachgelagerten Regionen von S. Aureus USA300 SAUSA300_0087 Pseudogene homologe Rekombination zu erleichtern. pRB4 leitet sich aus dem temperaturempfindliche pMAD Vektor-Backbone mit Erythromycin Widerstand Kassette (ErmC) und thermostabile Beta-Galaktosidase gen BgaB für blau/weiß-Screening von Recombinants³². Veränderter Reporter Konstrukt enthält auch einen Chloramphenicol-Widerstand-Marker (Katze) für Auswahl nach Genom Integration und Plasmid Beseitigung sowie EcoRI und SmaI Sites zu Sicherung die regulatorischen Region von Interesse für Superfolder grün fluoreszierenden Proteins (sGFP) (Abbildung 1). Es ist bekannt, dass die Wahl der Ribosom Bindungsstelle (RBS) die Aktivität des Reporters beeinflusst und häufig empirische Optimierung^{33 erfordert}. Somit wird eine RBS nicht mitgeliefert. Hier die native Ribosom Bindungsstelle wird verwendet, um ein natürliches Muster der Genexpression zur Verfügung stellen, aber andere Websites verwendet werden.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Georgetown University genehmigt. 1. Generation der fluoreszierenden Reporter Belastung Den Genom integrative pRB4 Vektor sequenziell mit EcoRI und SmaI Restriktionsenzymen zu verdauen. Nach Protokoll des Herstellers, eine Übernachtung Verdauung mit SmaI mit 1 µg der pRB4 bei 25 ° C, und fahren Sie dann mit der zweiten Verdauung für 1h bei 37 ° C, indem Sie das Reaktionsg…

Representative Results

Wir entwickelten ein Plasmid abgeleitet pMAD32 , die jeder Reporter liefern kann Fusion Konstrukt in das Chromosom durch doppelte Crossover homologe Rekombination (Abbildung 1). Diese Konstruktion ermöglicht Quantitative Analyse aller regulatorischen Regionen, die die Produktion von GFP-Protein und Fluoreszenzsignal über Hintergrund unterstützt. Das Plasmid verleiht die Ampicillin-Resistenz (Ap-f) für die Pflege und Verm…

Discussion

Bakterielle Infektionskrankheiten sind eine wachsende Gesundheitsproblem weltweit durch den Erwerb von Antibiotikaresistenz Determinanten⁴⁶. Denn Anpassung an Hostumgebungen wichtig für Wachstum und Überleben während der Infektion, können Strategien zielen gen-Ausdruck-Programme, die Erreger Fitness steigern therapeutisch nützlich erweisen. Ein solches Programm ist der Satz von Genen von SaeR/S zwei Komponentensystem (TCS), zuvor gezeigt, dass eine wichtige Rolle im Immunsystem Steuerhinterzi…

Materials

5% sheep blood	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 Mice	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
confocal laser scanning microscope	Zeiss	NA
cryostat microtome	Thermo Scientific	NA
Culture, Cap	VWR International	2005-02512
D+2:25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
Flow Analyzer	Becton Dickinson	NA
glass beads	Sigma	Z273627
Miniprep, plasmid	Promega	A1220
orbital shaking water bath	New Brunswick Innova	NA
PCR purification	QIagen	28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plate reader	Tecan	NA
Precellys 24 homogenizer	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Restriction Enzymes	New England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase	New England BioLabs	E6300L
Sanger Sequencing	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero clear tissue freezing medium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
Syringe, Filter	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Tryptic Soy Broth	VWR	90000-376
UV-visible spectrophotometer	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500