Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Summary

Qui descritto è un metodo per l’analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all’interno di una popolazione batterica in risposta all’ambiente del tessuto durante l’infezione.

Abstract

Geni di virulenza batterica sono spesso regolati a livello trascrizionale da diversi fattori, che rispondono a differenti segnali ambientali. Alcuni fattori agiscono direttamente sui geni di virulenza; altri controllano patogenesi regolando l’espressione di regolatori a valle o l’accumulo di segnali che influiscono sull’attività del regolatore. Mentre il regolamento è stato studiato estesamente durante la crescita in vitro , relativamente piccolo è conosciuto circa come espressione genica è regolata durante l’infezione. Tali informazioni sono importanti quando il prodotto di un particolare gene è un candidato per l’intervento terapeutico. Trascrizionali approcci come RT-PCR quantitativa, in tempo reale e RNA-Seq sono potenti modi per esaminare l’espressione genica a livello globale, ma soffrono di molte sfide tecniche, tra cui scarsa abbondanza di RNA batterico rispetto al host RNA e campione degradazione di RNAsi. Valutazione regolamento utilizzando reporter fluorescenti è relativamente facile ed è canalizzabile con proteine fluorescenti con proprietà spettrali uniche. Il metodo consente analisi unicellulare, spazio-temporale dell’espressione genica in tessuti che presentano complessi gradienti di architettura e chimico-fisico tridimensionale che influiscono sulle reti di regolazione batteriche. Tali informazioni vengono perse quando i dati sono una media sopra la popolazione di massa. Qui, descriviamo un metodo per quantificare l’espressione genica in batteri patogeni in situ. Il metodo si basa sull’elaborazione di tessuto semplice e diretta osservazione della fluorescenza da proteine reporter. Dimostriamo l’utilità di questo sistema esaminando l’espressione di Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), prodotto del gene di cui è necessario per evasione immune e virulenza completo ex vivo e in vivo. Vi mostriamo quello nuc-gfp è fortemente espresso in Ascessi renali e rivelare espressione genica eterogenei dovuti in parte al regolamento apparente spaziale dell’attività del promotore nuc in ascessi pienamente impegnata con la risposta immunitaria. Il metodo può essere applicato a qualsiasi batterio con un sistema genetico manipolabile e qualsiasi modello di infezione, fornendo informazioni preziose per gli studi preclinici e lo sviluppo di farmaci.

Introduction

Batteri di rispondere alle mutevoli condizioni fisiologiche e alterazioni dello stato nutrizionale del loro ambiente esprimendo differenzialmente geni richiesti per la sopravvivenza e di adattamento. Per esempio, agenti patogeni opportunistici colonizzano corpo superfici a relativamente basso densità e spesso sono innocui. Tuttavia, una volta che il batterio ha penetrato le barriere fisiche e chimiche, esso deve vedersela con contro-difese ospite delle cellule immuni e limitata disponibilità nutriente¹. Ad esempio, lo Staphylococcus aureus colonizza circa un terzo della popolazione senza sintomi ma è anche la causa della devastante della pelle e infezioni dei tessuti molli, osteomielite, endocardite e bacteremia². Il successo di S. aureus come agente patogeno è spesso attribuito a sua flessibilità metabolica, nonché un arsenale di fattori di virulenza secrete e superficie-collegati che permettono il batterio sfuggire il flusso sanguigno e replicare nei tessuti periferici ^3,4,5. Perché la morte di host a causa di malattia stafilococcica è un vicolo cieco dell’evoluzione e la trasmissione di limiti al nuovo host⁶, l’impegno per la produzione di fattore di virulenza deve essere controllato attentamente.

Una rete complessa regolamentazione di proteine e non-codificazione RNAs risponde ad una varietà di stimoli ambientali, tra cui cellulare densità, fase di crescita, fattori neutrofilo-collegati e disponibilità di nutrienti, per garantire che i geni di virulenza sono espresse alla tempo preciso e la posizione all’interno di host tessuti^{7,8,9,10,11,12,13}. Per esempio, il sistema a due componenti SaeR/S (TCS) regola l’espressione di numerosi fattori di virulenza attraverso la chinasi di sensore (SaeS) e la risposta regolatore (SaeR)¹⁴. SaeS è autophosphorylated su un residuo di istidina conservata in risposta a host segnali (ad es., umana del neutrofilo peptidi [HNPs], calprotectina)^8,15,16. Il gruppo fosforile viene poi trasferito ad un residuo di aspartato su SaeR, attivarlo come una proteina legante il DNA (SaeR ~ P)¹⁷. Il TCS SaeR/S regola oltre 20 geni che contribuiscono alla patogenesi tra cui proteine leganti di fibronectina (FnBPs), leukocidins e coagulasi^14,18,19,20. Gli obiettivi possono essere classificati in ad alta affinità e bassa affinità geni bersaglio, che sono probabilmente indotta come il livello di SaeR ~ P aumenta quando esposti a suoi spunti²¹. L’attività di SaeR/S è controllata da altri regolatori dell’espressione genica, come ad esempio il sistema di rilevamento del quorum di Agr, repressore della proteina di tossine (Rot) e il fattore sigma alternativo B (SigB)^22,23,24.

NUC è un gene di virulenza Sae-dipendente in stafilococco aureo e codifica thermonuclease (Nuc), che è essenziale per fuggire da neutrophilic einases traps (reti) e per diffusione durante il corso di infezione^25,26. L’espressione di nuc è anche fortemente indirettamente repressa da CodY in presenza di aminoacidi a catena ramificata e GTP²⁷e direttamente represso dalla proteina stafilococcica accessorio regolatore SarA^28,29 , cui l’attività è influenzata da ossigeno (stato redox) e pH³⁰. Dato che sae e nuc mutanti vengono attenuati in modelli murini di infezione, c’è interesse a sviluppare interventi chimici che inibiscono la loro corrispondente attività^26,31. Nonostante questo, non c’è nessuna informazione per quanto riguarda la loro regolazione durante l’infezione.

Reporter fluorescenti sono stati utilizzati per monitorare e quantificare l’espressione genica a livello di singola cellula. Qui, presentiamo un metodo per quantificare S. espressione genica aureus durante l’infezione che, quando accoppiato con l’analisi del trascrittoma in vitro e potenti tecniche di imaging come la risonanza magnetica (MRI) e la spettroscopia a risonanza magnetica (MRS), può rivelare come batterica fisiologia è regolata in vivo e l’abbondanza relativa delle sostanze nutrienti in alcune nicchie. Il metodo può essere applicato a qualsiasi agente patogeno batterico con un sistema genetico trattabile.

Panoramica del vettore integrativo del genoma.

PRB4 di vettore integrativo il genoma contiene 500 accoppiamenti bassi dalle regioni a Monte e a valle del pseudogene di S. aureus USA300 SAUSA300_0087 per facilitare la ricombinazione omologa. pRB4 è derivato dalla spina dorsale di vettore termosensibile pMAD contenente la cassetta di resistenza all’eritromicina (ermC) e beta-galattosidasi termostabile gene bgaB per lo screening blu/bianco di ricombinanti³². La costruzione del reporter ingegnerizzati contiene anche un indicatore di resistenza di cloramfenicolo (cat) per la selezione dopo l’integrazione del genoma ed eliminazione di plasmide, nonché siti EcoRI e SmaI di fondere la regione regolatrice di interesse al verde superfolder proteina fluorescente (sGFP) (Figura 1). È noto che la scelta del sito di legame del ribosoma (RBS) influenza l’attività del reporter e spesso richiede ottimizzazione empirica³³. Così, un RBS non è fornito. Qui, il sito di legame del ribosoma nativo viene utilizzato per fornire per un modello più naturale di espressione genica, ma altri siti possono essere utilizzati.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell’Università di Georgetown. 1. generazione del ceppo Reporter fluorescente Digerire il vettore di pRB4 integrativa del genoma in sequenza con enzimi di restrizione EcoRI e SmaI. Seguendo il protocollo del produttore, impostare una digestione durante la notte con SmaI utilizzando 1 µ g di pRB4 a 25 ° C e quindi procedere con la seconda digestione per 1h a 37 ° C con l’aggiunt…

Representative Results

Abbiamo sviluppato un plasmide derivato da pMAD32 in grado di fornire qualsiasi giornalista fusione costrutto nel cromosoma di ricombinazione omologa doppio crossover (Figura 1). Questo costrutto consente analisi quantitativa di qualsiasi regione regolatrice che sostiene la produzione di proteina GFP e segnale fluorescente sopra priorità bassa. Il plasmide conferisce resistenza all’ampicillina (Apr) per la manutenzione e la…

Discussion

Malattie infettive batteriche sono un crescente problema di salute in tutto il mondo grazie all’acquisizione di determinanti di resistenza agli antibiotici⁴⁶. Perché adattamento ad ambienti host è essenziale per la crescita e la sopravvivenza durante l’infezione, strategie basati su programmi di espressione genica che aumentano la forma fisica agente patogeno possono risultare utile terapeuticamente. Uno di questi programmi è l’insieme dei geni controllati dal sistema bicomponente SaeR/S (TCS),…

Materials

5% sheep blood	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 Mice	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
confocal laser scanning microscope	Zeiss	NA
cryostat microtome	Thermo Scientific	NA
Culture, Cap	VWR International	2005-02512
D+2:25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
Flow Analyzer	Becton Dickinson	NA
glass beads	Sigma	Z273627
Miniprep, plasmid	Promega	A1220
orbital shaking water bath	New Brunswick Innova	NA
PCR purification	QIagen	28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plate reader	Tecan	NA
Precellys 24 homogenizer	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Restriction Enzymes	New England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase	New England BioLabs	E6300L
Sanger Sequencing	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero clear tissue freezing medium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
Syringe, Filter	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Tryptic Soy Broth	VWR	90000-376
UV-visible spectrophotometer	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500