Summary

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

Published: February 19, 2019
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Summary

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。

Abstract

細菌の病原性遺伝子は多くの場合転写レベルで異なる環境シグナルに応答する複数の要因によって調整されます。いくつかの要因は病原性遺伝子に直接作用します。他の人は下流のレギュレータの式やレギュレータの活動に影響を与える信号の蓄積を調整することによって病態を制御します。規制は、生体外で成長中広く研究されている、しながら比較的感染時に遺伝子発現を調整する方法について少し知られています。そのような情報は、特定の遺伝子産物の治療的介入の候補であるときに重要です。転写のアプローチのように量的なリアルタイム RT-PCR 法と RNA シーケンスは、グローバル レベルでの遺伝子発現を調べるが、ホストの RNA とサンプルと比較して細菌の RNA の低い豊富を含む多くの技術的な課題に苦しむの強力な方法RNases による劣化。蛍光レポーターを使用して規制の評価は比較的簡単とユニークな波長特性を持つ蛍光タンパク質を用いた多重することができます。メソッドは、単一セル、時空間細菌制御ネットワークに影響を与える複雑な三次元アーキテクチャと物理化学的勾配を示す組織における遺伝子発現解析のためことができます。データは一括人口平均化と、このような情報は失われます。ここで、細菌性病原体の場で遺伝子の発現を定量化するための手法について述べる。メソッドは、単純なティッシュの処理と蛍光レポーター蛋白質からの直接観察に基づいています。黄色ブドウ球菌thermonuclease (nuc)、その遺伝子産物は免疫回避と ex vivo および in vivo における病原性に必要な発現を調べることによってこのシステムの有用性を示す.そのnuc gfpは強く腎膿瘍で表され、免疫応答による完全に従事して膿瘍におけるnucプロモーター活性の明白な空間規制の一部による異種遺伝子発現を明らかに示します。このメソッドは、操作可能な遺伝的システムに任意の細菌および前臨床研究と医薬品開発のための貴重な情報を提供する、任意の感染モデルに適用できます。

Introduction

細菌は、適応や生存に必要な遺伝子の差動表現で生理学的な条件と環境の栄養状態の変化の変化に対応します。例えば、日和見病原体には、ボディ表面は比較的低密度で無害なことが多いが植民地化します。ただし、細菌には、物理的・化学的障壁が浸透して、一度、ホスト免疫細胞カウンター防御と栄養アベイラビリティの制限1主張する必要があります。例として、黄色ブドウ球菌性感の人口の約 3 分の 1 の定着が、壊滅的な皮膚および軟部組織感染症、骨髄炎、心内膜炎、菌血症と2の原因でもあります。黄色ブドウ球菌の病原体としての成功は、その代謝の柔軟性だけでなく、細菌を血流を脱出し、末梢組織の複製を有効にする表面関連と分泌の病原因子の武器といわれる3,4,5。ブドウ球菌性疾患によるホスト死は進化の行き止まりと新しいホスト6伝送が制限、病原性因子産生へのコミットメントを慎重に制御する必要があります。

非コーディング RNAs 反応する様々 な環境刺激とタンパク質の複雑な規制のネットワークを含む細胞密度、成長期、好中球関連要因と養分可用性、病原性遺伝子がで表されることを確保するため、正確な時間、ホスト組織7,8,9,1011,12,13内の場所。例えば、サエル/S の 2 つのコンポーネント システム (TCS) は、センサー キナーゼ (サエス) と応答レギュレータ (サエル)14を介していくつかの病原因子の発現を調節します。サエスはホスト信号 (例,ひと好中球ペプチド [HNPs] カルプロテクチン)8,,1516レスポンスで節約されたヒスチジン残基の自己です。サエル、DNA 結合タンパク質としてそれをアクティブにするのにはアスパラギン酸残基にリン酸化グループ、転送されます (サエル ~ P)17。サエル/S TCS は、フィブロネクチン結合蛋白質 (FnBPs)、leukocidins、コアグラーゼ14,18,,1920など病態に寄与する 20 以上の遺伝子を調節します。サエルのレベルとして誘導の可能性がある高親和性・低親和性遺伝子ターゲットにターゲットを分類できます 〜 P 上昇その手がかり21に露出されたとき。サエル/S の活動は、Agr クォーラム センシング システムなど遺伝子発現の他の規制当局、毒素タンパク質 (Rot) と代替シグマ因子 B (SigB)22,23,24のリプレッサーによって制御されます。

nuc黄色ブドウ球菌の Sae 依存病原性遺伝子、 neutrophilic extracellular trap (ネット) から脱出するため、中に普及のために不可欠である thermonuclease (Nuc) をエンコード、感染25,26のコースです。Nucの式を分岐鎖アミノ酸と GTP27, 存在下でコーディでも強く直接に抑圧し、ブドウ球菌アクセサリー調節蛋白質サラ28,29 によって直接抑圧、その活動は、酸素 (酸化還元状態) と pH30によって影響されます。Sae nucの変異体は、感染症のマウスモデルの減衰は、ことを考える彼らの対応する活動26,31を阻害する化学の介入の開発に関心があります。それにもかかわらず、感染時の規制に関する情報はありません。

蛍光レポーターは、監視し、単一細胞レベルでの遺伝子の発現を定量化する使用されています。ここで、 Sの定量化手法を提案します。黄色ブドウ球菌感染症に発現する遺伝子と組み合わせればin vitro におけるトランスクリプトーム解析と磁気共鳴画像 (MRI) や磁気共鳴分光法 (MRS) のような強力なイメージング技術を明らかにすることができますどのように細菌生理学は、特定のニッチで栄養素の相対的な存在量で規制されています。メソッドは、扱いやすい遺伝的システムと細菌の病原体に適用できます。

ゲノムの統合的なベクトルの概要です。

ゲノム統合のベクトル pRB4 には、各相同組換えを促進する黄色ブドウ球菌usa 300 SAUSA300_0087偽遺伝子の上流と下流地域から 500 の塩基対が含まれています。pRB4 は、耐熱性 β-ガラクトシダーゼ遺伝子ガラクトシダーゼ組み換え32の青/白のスクリーニングのためのエリスロマイシン耐性カセット (ermC) を含む温度敏感な pMAD ベクター バックボーンから派生されます。設計された記者コンストラクトでは、ゲノム統合プラスミド除去と superfolder グリーンに関心の規制地域をヒューズに EcoRI および SmaI サイト後選択のクロラムフェニ コール耐性マーカー () も含まれています蛍光タンパク質 (sGFP) (図 1)。それは、リボソーム結合部位 (RBS) の選択が、レポーターの活動に影響を与える多くの場合経験的最適化33を必要とする知られています。したがって、RBS は付属されていません。ここでは、ネイティブ リボゾームの結合サイトは遺伝子発現のより自然なパターンを提供するために使用されるが、他のサイトを使用することがあります。

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョージタウン大学によって承認されています。 1. 蛍光レポーター歪みの世代 制限酵素 EcoRI と SmaI で順番にゲノム統合 pRB4 ベクトルを消化します。次の製造元のプロトコル SmaI 25 ° c、1 μ g の pRB4 を使用して一晩消化を設定、EcoRI を反応混合物に追加することによって 37 ° C で 1 時間 2 …

Representative Results

任意の記者を届けることができる pMAD32から派生したプラスミドを開発したダブル クロス オーバーの相同組み換え (図 1) による染色体に融合コンストラクト。このコンス トラクターは、GFP タンパク質と背景の上の蛍光信号の生成をサポートする任意の規制領域の定量分析のためことができます。プラスミッドのメンテナンス?…

Discussion

細菌感染症は、抗生の抵抗の決定要因の46の取得により世界的な増加する健康問題です。ホスト環境への適応は成長と感染中の生存に不可欠な病原体のフィットネスを高める遺伝子発現プログラムを見据えた戦略は治療役に立つかもしれない。1 つのようなプログラムは、サエル/S 2 つコンポーネント システム (TCS)、免疫回避47で重要な役割を再生する前に?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

フローサイトメトリー解析ヘルプについては PsarAP1– tdTomato 融合とカレン クレスウェルの贈り物ありがとうアレキサンダー Horswill。我々 はまた統計的な分析でアドバイスをアリッサ王をありがちましょう。この作品は、NIH 萌芽/発達研究賞 (グラント AI123708) と SRB 学部スタートアップ資金によって一部で賄われていた。資金提供者には、研究デザイン、データの収集と解釈、または出版物のための仕事を提出する決定の役割はなかった。

Materials

5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

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Cite This Article
Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).

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