감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

Summary

여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

Abstract

세균성 독성 유전자는 다른 환경 신호에 응답 하는 여러 요인에 의해 종종 transcriptional 수준에서 통제 된다. 몇 가지 요인을 행동 직접 독성 유전자; 다른 다운스트림 레 귤 레이 터의 식이나 레 귤 레이 터 활동에 영향을 주는 신호의 축적을 조정 하 여 병을 제어 합니다. 레 귤 레이 션 생체 외에 성장 하는 동안 광대 하 게 공부 하고있다, 동안 상대적으로 작은 유전자 발현은 감염 시 조정 하는 방법에 대 한 알려져 있다. 이러한 정보는 특정 유전자 제품은 치료 적 개입에 대 한 후보 때 중요 하다. Transcriptional 접근 같은 양적, 실시간 RT-PCR 및 RNA-Seq는 글로벌 수준에 유전자 발현 검사 하지만 호스트 RNA 및 샘플에 비해 세균 RNA의 낮은 풍부를 포함 하 여 많은 기술 문제에서 고통 하는 강력한 방법을 RNases에 의해 저하입니다. 평가 규칙 형광 기자를 사용 하 여 상대적으로 쉽게 하 고 독특한 스펙트럼 특성을 가진 형광 성 단백질으로 다중화 될 수 있다. 메서드는 복잡 한 3 차원 건축과 physiochemical 그라디언트 세균성 규제 네트워크에 영향을 주는 조직에서 유전자 발현의 단일 셀, spatiotemporal 분석 할 수 있습니다. 이러한 정보는 데이터 대량 인구 이상 평균 하는 때 손실 됩니다. 여기, 세균성 병원 체 제자리에서 유전자 발현을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 간단한 조직 처리 및 기자 단백질에서 형광의 직접 관찰을 기반으로 합니다. 우리는 포도 상 구 균 thermonuclease (nuc), 유전자 제품 면역 회피 및 전 비보, vivo에서 전체 독성은의 식을 검사 하 여이 시스템의 유틸리티를 보여 줍니다. 우리는 nuc gfp 신장 농 양 표현 하는 표시 완전히 면역 응답에와 함께 종사 하는 농에 nuc 발기인 활동의 명백한 공간 규정에 인해 이질적인 유전자 발현을 일부 공개. 까지의 유전자 시스템 어떤 박테리아와 감염 모델, 전 임상 연구 및 신약 개발에 대 한 귀중 한 정보를 제공 하는 메서드를 적용할 수 있습니다.

Introduction

박테리아는 차동 적응과 생존에 필요한 유전자를 표현 하 여 생리 적 조건 및 그들의 환경에의 영양 상태에 변경 변경에 응답 합니다. 예를 들어, 기회 주의 병원 체는 몸 표면에 상대적으로 낮은 밀도, 그리고 자주 무해 한 식민지. 그러나, 박테리아는 물리적, 화학적 장벽을 침투 하 고, 일단 그것은 호스트 면역 세포 카운터 방어와 제한 된 양분 가용성¹맞설 까 해야 합니다. 예를 들어, 황색 포도상구균 인구의 약 1/3를 asymptomatically colonizes 하지만 치명적인 피부 및 연 조직 감염, 도왔습니다, 심장 내 막 염, 그리고 bacteremia²의 원인입니다. S. 구 균 병원 체로 서의 성공은 종종 대사 유연성 뿐만 아니라 혈 류를 탈출 하 고 주변 조직 ^{에서에서 복제에 박테리아 수 있도록 표면에 연결 하 고 분 비 독성 요인의 특성을 사용합니다 3,,45}. 호스트 죽음 포도 질병 때문 이며 진화 막다른 한계 전송 새 호스트⁶, 때문에 독성 요소 생산 하겠다는 신중 하 게 제어 해야 합니다.

밀도, 성장 단계, neutrophil 관련 요인, 및 독성 유전자가에 표현 되도록 양분 가용성 단백질 및 비 코딩 RNAs 응답 다양 한 환경 자극의 복잡 한 규제 네트워크, 세포 등에서 정확한 시간과 위치 호스트 조직^{7,8,9,10,11,,1213}. 예를 들어, SaeR/S 두 구성 요소 시스템 (TCS) 조절 센서 키 (SaeS)와 응답 레 귤 레이 터 (SaeR)¹⁴를 통해 여러 독성 요인의 표현. SaeS는 호스트 신호 (예:, 인간 호 중구 펩 티 드 [HNPs] calprotectin)^8,,1516응답에서 보존된 히스티딘 잔류물에 autophosphorylated입니다. Phosphoryl 그룹은 다음 aspartate 잔류물에 전송 SaeR, DNA 묶는 단백질으로 활성화 (SaeR ~ P)¹⁷. SaeR/S TCS fibronectin 의무적인 단백질 (FnBPs), coagulase^14,18,,1920, leukocidins, 등 병 인에 기여 하는 20 개 이상의 유전자를 통제 한다. 대상 SaeR의 수준으로 유발 확률이 높은 친 화력과 낮은 선호도 유전자 대상으로 분류 될 수 있다 ~ P 상승의 신호²¹에 노출 되 면. SaeR/S 활동 Agr 쿼럼 감지 시스템 같은 유전자 발현의 다른 레 귤 레이 터, 독 소 단백질 (썩 음), 그리고 대체 시그마 요인 B (SigB)^22,,2324의 진압에 의해 제어 됩니다.

nuc 황색 포도상구균 에 성폭력 종속 독성 유전자 이며 neutrophilic extracellular t비난 (그물)에서 탈출 한 동안 보급을 위한 필수적 이다 thermonuclease (Nuc)를 인코딩하는 감염^25,26의 과정. Nuc 의 식은 강하게 직접 측 쇄 사슬 아미노산, GTP²⁷, 존재 코디에 의해 하지 억압 이며 직접 포도 액세서리 레 귤 레이 터 단백질 사라^{28,29에 의해 억압} , 그의 활동이 산소 (산화 환 원 상태)와 산도³⁰에 의해 좌우 된다. 성폭력 및 nuc 돌연변이 감염 마우스 모델에서 감쇠는, 그에 주어진 그들의 해당 활동^26,31을 억제 하는 화학 개입 개발에 관심이 있다. 그럼에도 불구 하 고, 감염 시 그들의 규제에 관한 어떠한 정보도가 있다.

형광 기자 모니터링 하 고 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 정량 사용 되었습니다. 여기, 우리는 S를 측정 하는 방법 제시. 감염 시 균 유전자 발현,와 결합 될 때 체 외 transcriptome 분석 및 자기 공명 영상 (MRI) 및 자기 공명 음 분광학 (MRS) 같은 강력한 이미징 기술을 계시 할 수 있다 어떻게 세균 생리학은 vivo 및 특정 틈새에서 영양소의 상대적 나타났는데에서 통제 된다. 메서드는 그러므로 유전 시스템과 어떤 세균성 병원 체에 적용할 수 있습니다.

게놈 통합 벡터의 개요입니다.

게놈 통합 벡터 pRB4 500 기본 쌍 각 동종 재결합을 촉진 하기 위하여 S. 구 균 USA300 SAUSA300_0087 pseudogene의 상류와 하류 지역에서 포함 되어 있습니다. pRB4는 리스로 마이 신 저항 카세트 (ermC)와 recombinants³²의 블루/화이트 심사에 대 한 내 베타-galactosidase 유전자 bgaB 를 포함 하는 온도 민감한 pMAD 벡터 등뼈에서 파생 됩니다. 조작된 기자 구문 또한 들어 페니 저항 마커 (고양이) 게놈 통합 및 플라스 미드 제거 뿐만 아니라 관심 superfolder 녹색 규제 영역을 융합 EcoRI와 SmaI 사이트 후 선택 형광 성 단백질 (sGFP) (그림 1). 그것은 알려져 그 리보솜 바인딩 사이트 (RBS)의 기자의 활동에 영향을 하며 종종 경험적 최적화³³. 따라서,는 RBS는 제공 되지. 여기, 네이티브 리보솜 바인딩 사이트는 유전자 발현의 좀 더 자연 스러운 패턴에 대 한 제공 하는 데 사용 됩니다 하지만 다른 사이트를 사용할 수 있습니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 조지타운 대학에 의해 승인 되었습니다. 1입니다. 형광 기자 스트레인의 발생 게놈 통합 pRB4 벡터 순차적으로 EcoRI 및 SmaI 금지 효소로 소화. 제조 업체의 프로토콜을 따르고 25 ° C에서 1 µ g의 pRB4 사용 하 여 SmaI와 하룻밤 소화를 설정 하 고 37 ° C에서 1 시간에 대 한 두 번째 소화 EcoRI 반응 혼합물에 ?…

Representative Results

우리는 어떤 기자를 제공할 수 있는 pMAD32 에서 파생 된 플라스 미드를 개발 더블 크로스 오버 동종 재결합 (그림 1)에 의해 염색체에 퓨전 구문. 이 구조는 GFP 단백질 생산 배경 위에 형광 신호를 지 원하는 어떤 규제 지역의 정량 분석에 대 한 수 있습니다. 플라스 미드 암 피 실린 저항 (Apr) 유지 보수 및 대장균 에서 ?…

Discussion

세균 감염 증은 항생제 내성 결정 요인⁴⁶의 수집으로 인해 전세계 증가 건강 문제. 호스트 환경에 적응 성장과 감염 동안 생존을 위해 필수적 이다, 때문에 병원 체 적당을 증가 하는 유전자 식 프로그램을 대상으로 전략 therapeutically 유용한 증명할 수 있습니다. 하나는 이러한 프로그램이 SaeR/S 두 구성 요소 시스템 (TCS), 면역 회피⁴⁷에 필수적인 역할을 이전 표시?…

Materials

5% sheep blood	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 Mice	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
confocal laser scanning microscope	Zeiss	NA
cryostat microtome	Thermo Scientific	NA
Culture, Cap	VWR International	2005-02512
D+2:25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
Flow Analyzer	Becton Dickinson	NA
glass beads	Sigma	Z273627
Miniprep, plasmid	Promega	A1220
orbital shaking water bath	New Brunswick Innova	NA
PCR purification	QIagen	28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plate reader	Tecan	NA
Precellys 24 homogenizer	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Restriction Enzymes	New England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase	New England BioLabs	E6300L
Sanger Sequencing	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero clear tissue freezing medium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
Syringe, Filter	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Tryptic Soy Broth	VWR	90000-376
UV-visible spectrophotometer	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500