Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Summary

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Abstract

Genes de virulência bacteriana frequentemente são regulados a nível transcricional por múltiplos fatores que respondem a sinais ambientais diferentes. Alguns fatores agem diretamente sobre os genes de virulência; outros controlam patogênese ajustando a expressão dos reguladores a jusante ou a acumulação de sinais que afetam a atividade do regulador. Enquanto o regulamento tem sido estudado extensivamente durante o crescimento em vitro , relativamente pouco se sabe sobre como a expressão gênica é ajustada durante a infecção. Tal informação é importante quando um produto do gene específico é um candidato para a intervenção terapêutica. Abordagens transcriptional como RT-PCR em tempo real, quantitativo e RNA-Seq são maneiras poderosas para examinar a expressão do gene em um nível global, mas sofrem muitos desafios técnicos, incluindo baixa abundância de RNA bacteriano comparado ao RNA do hospedeiro e amostra degradação por RNases. Avaliar o Regulamento usando repórteres fluorescentes é relativamente fácil e pode ser multiplexado com proteínas fluorescentes com propriedades espectrais únicas. O método permite a célula única, spatiotemporal análise de expressão gênica em tecidos que apresentam tridimensional arquitetura e physiochemical gradientes complexos que afetam redes de regulação bacterianas. Tais informações são perdidas quando dados são calculados sobre a população em massa. Aqui, descrevemos um método para quantificar a expressão gênica em patógenos bacterianos in situ. O método baseia-se no processamento do tecido simples e observação directa da fluorescência das proteínas de repórter. Vamos demonstrar a utilidade deste sistema, examinando a expressão de Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), cujo produto gênico é necessário para evasão imune e virulência completa ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp é fortemente expressos em abcessos renais e revelar expressão de gene heterogêneo devido em parte à aparente regulação espacial da atividade de promotor nuc em abcessos totalmente engajado com a resposta imune. O método pode ser aplicado a qualquer bactéria com um sistema genético manipulável e qualquer modelo de infecção, fornecendo informações valiosas para o desenvolvimento de drogas e estudos pré-clínicos.

Introduction

Bactérias respondem às novas condições fisiológicas e alterações no estado nutricional de seu ambiente expressando diferencialmente genes necessários para adaptação e sobrevivência. Por exemplo, patógenos oportunistas colonizam o corpo superfícies em relativamente baixa densidades e muitas vezes são inofensivos. No entanto, uma vez que a bactéria penetrou barreiras físicas e químicas, deve lidar com as Counter-defesas de célula imune do hospedeiro e disponibilidade de nutrientes restrita¹. Por exemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente um terço da população assintomaticamente, mas é também a causa do devastador de pele e infecções de tecidos moles, osteomielite, endocardite e bacteriemia². O sucesso de S. aureus como um patógeno é frequentemente atribuído à sua flexibilidade metabólica, bem como um arsenal de fatores de virulência associada a superfície e secretada que permitem que a bactéria escapar na corrente sanguínea e replicar em tecidos periféricos ^3,4,5. Porque o anfitrião a morte devido à doença estafilocócica é um beco sem saída evolutivo e transmissão de limites a novos hospedeiros⁶, o compromisso com a produção de factor de virulência deve ser cuidadosamente controlado.

Uma complexa rede de regulação das proteínas e responde RNA não-codificante para uma variedade de estímulos ambientais, incluindo celular, densidade, fase de crescimento, fatores associados neutrófilos e disponibilidade de nutrientes, para garantir que os genes de virulência são expressos nas hora exacta e localização dentro do hospedeiro, tecidos^{7,8,9,10,11,12,13}. Por exemplo, o sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS) regula a expressão de vários fatores de virulência através da quinase do sensor (PEA) e a resposta regulador (SaeR)¹⁴. Pea é autophosphorylated em um resíduo de histidina conservada em resposta a sinais (por exemplo,, humana neutrófilos peptídeos [HNPs], calprotectin) de acolhimento a^8,15,16. O grupo de fosforilo é então transferido para um resíduos de aspartato na SaeR, ativando-o como uma proteína de ligação a DNA (SaeR ~ P)¹⁷. O TCS SaeR/S regula mais de 20 genes que contribuem para a patogênese incluindo fibronectina proteínas (FnBPs) e leucocidinas estafilococos coagulase^14,18,19,20. Metas podem ser classificadas em alvos de alta afinidade e baixa afinidade do gene, que possam induzido como o nível de SaeR ~ P levanta-se quando exposto a suas sugestões²¹. A atividade de SaeR/S é controlada por outros reguladores da expressão gênica, como o sistema de sensoriamento de quórum Agr, repressor de proteína de toxinas (Rot) e a alternativa fator sigma B (SigB)^22,23,24.

NUC é um gene de virulência Sae-dependente em Staphylococcus aureus e codifica thermonuclease (Nuc), que é essencial para escapar do neutrophilic extracellular traps (redes) e para divulgação durante o curso de infecção^25,26. A expressão do nuc é também fortemente indiretamente reprimida pelo CodY na presença de aminoácidos de cadeia ramificada e GTP²⁷e diretamente reprimida pela proteína estafilocócica regulador acessório SarA^28,29 , cuja actividade é influenciada pelo oxigênio (estado de redox) e pH³⁰. Dado que sae e nuc mutantes são atenuados em modelos do rato de infecção, há interesse em desenvolver intervenções químicas que inibem a sua correspondente atividades^26,31. Apesar disso, não há nenhuma informação sobre sua regulação durante a infecção.

Repórteres fluorescentes tem sido usados para monitorar e quantificar a expressão do gene no nível da célula única. Neste documento, apresentamos um método para a quantificação dos S. aureus expressão gênica durante a infecção que, quando combinadas com in vitro transcriptome análise e poderosas técnicas de imagem como a ressonância magnética (MRI) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS), pode revelar como bacteriana fisiologia está regulamentada no vivo e a abundância relativa de nutrientes em determinados nichos. O método pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano com um sistema genético tractable.

Visão geral do vetor Integrativa do genoma.

O genoma Integrativa vector pRB4 contém 500 pares de bases cada das regiões a montante e a jusante do pseudogene do S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar o recombination homologous. pRB4 é derivado de backbone sensíveis à temperatura pMAD vetor contendo a gaveta de resistência de eritromicina (ermC) e beta-galactosidase thermostable gene bgaB para rastreio de azul/branco, recombinants³². A construção de engenharia repórter também contém um marcador de resistência de cloranfenicol (gato) para a seleção após a integração do genoma e eliminação do plasmídeo, bem como locais de EcoRI e SmaI para fundir a região reguladora de interesse para verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (Figura 1). É conhecido que a escolha do sítio de ligação do ribossomo (RBS) influencia a atividade do repórter e muitas vezes requer otimização empírica³³. Assim, um RBS não é fornecido. Aqui, o sítio de ligação do ribossomo nativo é usado para fornecer um padrão mais natural da expressão do gene, mas outros sites podem ser utilizados.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Georgetown e institucional Cuidado Animal. 1. geração da estirpe repórter fluorescentes Digeri o vetor de pRB4 Integrativa do genoma sequencialmente com enzimas de restrição EcoRI e SmaI. Seguindo o protocolo do fabricante, configurar uma digestão durante a noite com SmaI usando 1 µ g de pRB4 a 25 ° C e então prosseguir com a segunda digestão durante 1h a 37 ° C, adicionando Eco…

Representative Results

Desenvolvemos um plasmídeo derivado pMAD32 que pode entregar qualquer repórter construção de fusão para o cromossomo por recombinação homóloga de cruzamento duplo (Figura 1). Esta construção permite a análise quantitativa de qualquer região reguladora que suporta a produção de proteína GFP e sinal fluorescente acima do fundo. O plasmídeo confere resistência ampicilina (Apr) para a manutenção e propagação…

Discussion

Doenças infecciosas bacterianas são um crescente problema de saúde em todo o mundo devido à aquisição de resistência aos antibióticos determinantes⁴⁶. Porque a adaptação a ambientes de host é essencial para o crescimento e sobrevivência durante a infecção, estratégias visando programas de expressão do gene que aumentam a aptidão do patógeno podem ser útil terapeuticamente. Um desses programas é o conjunto de genes controlados pelo sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS), mo…

Materials

5% sheep blood	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 Mice	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
confocal laser scanning microscope	Zeiss	NA
cryostat microtome	Thermo Scientific	NA
Culture, Cap	VWR International	2005-02512
D+2:25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
Flow Analyzer	Becton Dickinson	NA
glass beads	Sigma	Z273627
Miniprep, plasmid	Promega	A1220
orbital shaking water bath	New Brunswick Innova	NA
PCR purification	QIagen	28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plate reader	Tecan	NA
Precellys 24 homogenizer	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Restriction Enzymes	New England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase	New England BioLabs	E6300L
Sanger Sequencing	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero clear tissue freezing medium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
Syringe, Filter	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Tryptic Soy Broth	VWR	90000-376
UV-visible spectrophotometer	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500