JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
유전학

Для изучения бактериальный ген регулирование в инфицированных тканях метод, основанный на флуоресцирования

Published: February 19, 2019
doi:
10.3791/59055
, , ,
1Department of Biology,Georgetown University

Summary

Описанные здесь — это метод для анализа экспрессии генов бактерий в животных тканях на клеточном уровне. Этот метод предоставляет ресурс для изучения фенотипического разнообразия, происходящих в пределах бактериальная популяция в ответ на ткани окружающей среды во время инфекции.

Abstract

Генов вирулентности бактерий, часто регулируются на уровне транскрипционный анализ многочисленных факторов, которые реагируют на различные экологические сигналы. Некоторые факторы действуют непосредственно на генов вирулентности; другие управления патогенеза, регулируя выражение течению регуляторов или накопление сигналов, которые влияют на активность регулятор. В то время как регулирование широко изучен во время роста в пробирке , относительно мало известно о как выражение гена корректируется во время инфекции. Такая информация имеет важное значение, когда продукт определенного гена является кандидатом для терапевтического вмешательства. Транскрипционный анализ подходов, как количественных, реальном времени RT-PCR и РНК-Seq мощных способов изучения экспрессии генов на глобальном уровне, но страдают от многих технических проблем, включая низкий обилие бактериальной РНК, по сравнению с принимающей РНК и пример деградация, полиадениновый. Оценки регулирования с использованием флуоресцентных Репортеры сравнительно легко и может быть мультиплексированием с флуоресцентных белков с уникальными спектральных свойств. Метод позволяет для одной ячейки, пространственно-временных анализ экспрессии генов в тканях, которые демонстрируют сложные трехмерные архитектуры и физико градиенты, которые влияют на бактериальных регулирования сети. Такая информация теряется, когда данные усредняются над населением оптом. Здесь мы описываем метод количественной оценки экспрессии генов в бактериальных патогенов в situ. Метод основан на обработке простой ткани и прямого наблюдения флуоресценции белков репортер. Мы продемонстрировать полезность этой системы путем изучения выражение стафилококк thermonuclease (КНУ), чей продукт гена необходим для иммунной уклонения и полное вирулентности ex vivo и in vivo. Мы покажем, что nuc-gfp сильно выражена в почечной абсцессов и частично разглашать гетерогенных ген выражение из-за очевидной пространственных регулирования деятельности промоутер КНУ в гнойнички, полностью занимается иммунного ответа. Этот метод может применяться к любой бактерии с манипулируемой генетическую систему и модель любой инфекции, предоставляя ценную информацию для доклинических исследований и разработки лекарств.

Introduction

Бактерии реагировать на меняющиеся физиологические условия и изменения в состоянии питания их окружающей среды дифференциально выражением генов, необходимых для адаптации и выживания. К примеру оппортунистических патогенов колонизировать тела поверхностей при относительно низкой плотности и зачастую безвредны. Однако после бактерии проникли физические и химические барьеры, он должен бороться с принимающей иммунных клеток борьбе с оборону и ограниченного наличия питательных веществ1. Например золотистый стафилококк колонизирует приблизительно одну треть населения бессимптомно, но также является причиной разрушительных кожи и инфекций мягких тканей, остеомиелит, эндокардит и бактериемии2. Успех S. aureus как возбудитель часто приписывают его метаболические гибкость, а также целый арсенал Факторы вирулентности связанных с поверхности и выделяется, позволяющие бактерии бежать кровоток и реплицировать в периферических тканях 34,,5. Потому что хост смерть из-за стафилококковых болезней является эволюционным тупик и ограничивает передачу новых хостов6, приверженность производства фактор вирулентности должен тщательно контролироваться.

Комплекс нормативных сети белков и некодирующих RNAs реагирует на различные экологические стимулы, включая ячейки плотности, фазы роста, нейтрофилов связанных факторов и наличия питательных веществ, чтобы обеспечить, что генов вирулентности выражаются в Точное время и место в пределах узла ткани7,8,9,10,11,12,13. Например два компонента системы SaeR/S (TCS) регулирует выражение нескольких факторов вирулентности через датчик киназы (SaeS) и ответ регулятор (SaeR)14. SaeS является autophosphorylated на сохранение гистидина остатков в ответ на принимающей сигналы (например, человеческих нейтрофилов пептидов [HNPs], calprotectin)8,,1516. Фосфорила группа затем передается аспартат остатков на SaeR, активация его как ДНК связывающих белков (SaeR ~ P)17. TCS SaeR/S регулирует более 20 генов, которые способствуют патогенеза, включая белки, связывающие фибронектина (FnBPs), лейкоцидины и ванкомицина14,18,19,20. Цели могут быть классифицированы высокоспецифичные и низкого сродства гена цели, которые, вероятно, индуцированной как уровень SaeR ~ P поднимается при контакте с его сигналы21. SaeR/S деятельность контролируется другими регуляторами экспрессии генов, например системы ДЗЗ кворума СМА, репрессор токсинов белка (Rot), и альтернативная Сигма фактор B (SigB)22,23,24.

КНУ это гена вирулентности Sae зависимых в золотистый стафилококк и кодирует thermonuclease (КНУ), которая необходима для побега от neutrophilic extracellular тударять (сетки), а также для распространения во время курс инфекции25,26. Выражение КНУ также сильно косвенно репрессирован Коди присутствии разветвленных аминокислот и ГТУ27и непосредственно репрессирован стафилококковых аксессуар регулятор белка Сара28,29 , деятельность которой находится под влиянием кислорода (окислительно-восстановительного состояния) и рН30. Учитывая, что sae и КНУ мутантов ослабленных в моделях мыши инфекции, есть интерес к разработке химического вмешательства, которые препятствуют их соответствующие мероприятия26,31. Несмотря на это нет никакой информации относительно их регулирования во время инфекции.

Флуоресцентный Репортеры были использованы для мониторинга и количественной оценки экспрессии генов на уровне одной ячейки. Здесь мы представляем метод количественной оценки S. стафилококк экспрессии генов во время инфекции, когда в паре с в пробирке транскриптом анализ и мощные методы визуализации как магнитно-резонансная томография (МРТ) и магнитно-резонансная спектроскопия (MRS), можно выявить как бактериальный Физиология регулируется в естественных условиях и относительного обилия питательных веществ в определенных нишах. Этот метод может применяться для любых бактериальных патогенов с шансов справиться с возникающими генетической системы.

Обзор генома интегративной вектора.

PRB4 интегративной вектор геном содержит 500 низкопробных пар из вышестоящих и нижестоящих регионов Псевдогены S. aureus USA300 SAUSA300_0087 для облегчения гомологичная рекомбинация. pRB4 является производным от чувствительных к температуре pMAD вектор позвоночник содержащий эритромицин сопротивления кассеты (ermC) и термостабильные бета галактозидазы гена bgaB отбора синий/белый рекомбинантов32. Инженерии репортер конструкции также содержит маркер сопротивления Хлорамфеникол (кошка) для выделения после интеграции генома и плазмиды ликвидации, а также EcoRI и ссии сайты предохранитель регулирования региона, представляющих интерес для superfolder зеленый флуоресцентный белок (sGFP) (рис. 1). Известно, что выбор рибосома привязки сайта (RBS) влияет на деятельность журналиста и часто требует эмпирической оптимизации33. Таким образом больших двоичных объектов не поддерживается. Здесь родной рибосома привязки сайт используется для предоставления для шаблона более естественный экспрессии генов, но другие сайты могут быть использованы.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Джорджтаунского университета. 1. поколение штамма флуоресцентные репортер Дайджест генома интегративной pRB4 вектор последовательно с EcoRI и ссии энзимов ограни…

Representative Results

Мы разработали плазмида, производный от pMAD32 , который может доставить любой репортер сплавливания построить в хромосоме, двойной кроссовер гомологичная рекомбинация (рис. 1). Эта конструкция позволяет для количественного анализа любого ре…

Discussion

Бактериальных инфекционных заболеваний являются растущей проблемой здравоохранения во всем мире за счет приобретения антибиотикорезистентности детерминанты46. Потому, что адаптация к принимающей среде имеет важное значение для роста и выживания во время инфекции, страт…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Александра Horswill за дар PsarAP1– tdTomato fusion и Карен Кресвелл за помощь с cytometry анализ потока. Мы также благодарим Alyssa короля за консультацией по статистического анализа. Эта работа частично финансируется NIH награду разведочных/развития исследований (Грант AI123708) и факультет запуска средства SRB. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и толкование или решение представить работу для публикации.

Materials

5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Tags

Bacterial Gene RegulationFluorescence-based MethodBacterial Gene ExpressionS. AureusHemolytic PhenotypeBacterial PhysiologyAntivirulenceAntibacterial CompoundsCryosectioningDAPI Staining
check_url/kr/59055?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image