Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

Summary

Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.

Abstract

Genes de virulencia bacteriana a menudo están regulados a nivel transcripcional por múltiples factores que responden a señales ambientales diferentes. Algunos factores que actúan directamente sobre los genes de virulencia; otros controlan patogenesia ajustando la expresión de los reguladores de aguas abajo o la acumulación de señales que afectan la actividad de regulador. Mientras que el Reglamento ha sido estudiado ampliamente durante el crecimiento en vitro , relativamente poco se sabe sobre cómo se ajusta la expresión génica durante la infección. Dicha información es importante cuando el producto de un gen particular es un candidato para la intervención terapéutica. Enfoques transcripcionales como RT-PCR cuantitativa en tiempo real, y RNA-Seq son poderosas formas de examinar la expresión génica a nivel global pero sufren muchos problemas técnicos incluyendo la baja abundancia de RNA bacteriana en comparación con el RNA del anfitrión y muestra degradación por RNasas. Evaluación de regulación utilizando reporteros fluorescentes es relativamente fácil y puede ser multiplexado con proteínas fluorescentes con propiedades espectrales únicas. El método permite el análisis unicelular, espacio-temporal de la expresión génica en los tejidos que presentan complejas tridimensionales gradientes arquitectura y fisicoquímicos que afectan redes de regulación bacterianas. Dicha información se pierde cuando se calcula el promedio de los datos sobre la población a granel. Adjunto, describimos un método para cuantificar la expresión génica en bacterias patógenas in situ. El método se basa en el procesamiento de tejido simple y directa observación de la fluorescencia de proteínas de reportero. Demostramos la utilidad de este sistema mediante el examen de la expresión de la thermonuclease de Staphylococcus aureus (nuc), cuyo producto del gene es necesario para la evasión inmune y la virulencia completo ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp se expresa fuertemente en abscesos renales y revelar expresión génica heterogénea debido en parte a la aparente regulación espacial de la actividad de promotor de nuc en abscesos comprometidos plenamente con la respuesta inmune. El método puede aplicarse a cualquier bacteria con un sistema de genético manipulable y cualquier modelo de la infección, proporcionando información valiosa para los estudios preclínicos y desarrollo de fármacos.

Introduction

Las bacterias responden a cambiar condiciones fisiológicas y las alteraciones en el estado nutricional de su entorno expresando diferencialmente genes necesarios para la adaptación y supervivencia. Por ejemplo, patógenos oportunistas colonizan cuerpo superficies en relativamente bajas densidades y suelen ser inofensivos. Sin embargo, una vez que la bacteria ha penetrado las barreras físicas y químicas, deben lidiar con el anfitrión célula inmune contra defensas y restringida la disponibilidad de nutrientes¹. Por ejemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente un tercio de la población de forma asintomática pero también es la causa de la piel devastador e infecciones de tejidos blandos, osteomielitis, endocarditis y bacteremia². El éxito de S. aureus como patógeno a menudo se atribuye a su flexibilidad metabólica, así como un arsenal de factores de virulencia asociados a superficie y secretada que permiten a la bacteria escapar el torrente sanguíneo y replicar en tejidos periféricos ^3,4,5. Porque la muerte del anfitrión debido a la enfermedad estafilocócica es un callejón sin salida evolutivo y límites de transmisión a nuevos anfitriones⁶, debe controlarse cuidadosamente el compromiso con la producción del factor de virulencia.

Una compleja red de regulación de proteínas y no-codificación RNAs responde a una variedad de estímulos ambientales, incluyendo la célula densidad, fase de crecimiento, factores asociados del neutrófilo y la disponibilidad de nutrientes, para asegurar que los genes de virulencia se expresan en la hora exacta y la ubicación en host tejidos^{7,8,9,10,11,12,13}. Por ejemplo, el sistema de dos componentes de SaeR/S (TCS) regula la expresión de varios factores de virulencia a través de la cinasa del sensor (SaeS) y la respuesta de regulador (SaeR)¹⁴. SaeS es autophosphorylated en un residuo conservado de histidina en respuesta a señales (e.g., humano neutrófilos péptidos [HNPs], calprotectina) de host^8,15,16. El grupo fosforilo es entonces transferido a un residuo de aspartato en SaeR, activarlo como una proteína de unión al ADN (SaeR ~ P)¹⁷. El TCS SaeR/S regula más de 20 genes que contribuyen a la patogénesis, incluyendo proteínas de unión de fibronectina (FnBPs), leukocidins y coagulasa^14,18,19,20. Objetivos se pueden clasificar en objetivos gene de alta afinidad y baja afinidad, que son probablemente inducida como el nivel de SaeR ~ P se levanta cuando se exponen a sus señales²¹. La actividad de SaeR/S es controlada por otros reguladores de expresión génica como el sistema de detección de quórum de Agr, represor de las toxinas proteínas (putrefacción) y el factor sigma alternativo B (SigB)^22,23,24.

NUC es un gen de virulencia dependientes de la Sae en Staphylococcus aureus y codifica thermonuclease (Nuc), que es esencial para escapar de neutrophilic extracellular traps (redes) y para su difusión durante la curso de la infección^25,26. La expresión de nuc es también fuertemente indirectamente reprimida por CodY en presencia de los aminoácidos de cadena ramificada y GTP²⁷y directamente reprimida por la proteína estafilocócica regulador accesorio SarA^28,29 , cuya actividad está influenciada por el oxígeno (estado redox) y pH³⁰. Dado que sae y nuc mutantes se atenúan en modelos de ratón de la infección, hay interés en el desarrollo de intervenciones químicas que inhiben sus correspondientes actividades^26,31. A pesar de esto, no hay información con respecto a su regulación durante la infección.

Reporteros fluorescentes se han utilizado para controlar y cuantificar la expresión génica a nivel unicelular. Adjunto, presentamos un método para cuantificar el S. aureus expresión génica durante la infección, cuando se combina con análisis de transcriptoma en vitro y potentes técnicas de imagen como resonancia magnética (MRI) y espectroscopia de resonancia magnética (MRS), puede revelar cómo bacteriana Fisiología está regulada in vivo y la relativa abundancia de nutrientes en ciertos nichos. El método puede aplicarse a cualquier patógeno bacteriano con un manejable sistema de genético.

Resumen del vector integrador de genoma.

El pRB4 vector integrador de genoma contiene 500 pares de bases cada uno de las regiones de aguas arriba y aguas abajo del pseudogene S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar la recombinación homóloga. pRB4 se deriva de la columna vertebral de vector pMAD sensibles a la temperatura que contiene el cassette de resistencia a eritromicina (ermC) y beta-galactosidasa termoestable gene bgaB para azul/blanco cribado de recombinantes³². La construcción de ingeniería reportero también contiene un marcador de resistencia a cloranfenicol (cat) para la selección después de la integración del genoma y eliminación de plásmido, así como sitios de EcoRI y SmaI fusionar la región reguladora de interés verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (figura 1). Se sabe que la elección del sitio de unión a ribosoma (RBS) influye en la actividad del reportero y a menudo requiere optimización empírica³³. Por lo tanto, no se suministra un RBS. Aquí, el sitio de unión del ribosoma nativa se utiliza para proporcionar un patrón natural de la expresión génica, pero pueden utilizarse otros sitios.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Georgetown. 1. generación de la cepa de reportero fluorescente Digerir el vector de pRB4 integradora de genoma secuencialmente con enzimas de restricción EcoRI y SmaI. Siguiendo el protocolo del fabricante, configurar una digestión durante la noche con SmaI con 1 μg de pRB4 a 25 ° C y luego proceder con la segunda digestión por 1h a 37 ° C med…

Representative Results

Hemos desarrollado un plásmido derivado pMAD32 que puede ofrecer cualquier reportero construcción de fusión en el cromosoma por recombinación homóloga doble cruce (figura 1). Esta construcción permite el análisis cuantitativo de cualquier región reguladora que apoya la producción de la proteína GFP y la señal fluorescente sobre fondo. El plásmido confiere resistencia a la ampicilina (Apr) para el mantenimiento y …

Discussion

Enfermedades infecciosas bacterianas son un problema de salud creciente en todo el mundo debido a la adquisición de los determinantes de resistencia antibiótica⁴⁶. Porque la adaptación a entornos de host es esencial para el crecimiento y supervivencia durante la infección, estrategias dirigidas a programas de expresión génica que aumentan la aptitud del patógeno pueden resultar útiles terapéuticamente. Un tal programa es el conjunto de genes controlados por el sistema de dos componentes d…

Materials

5% sheep blood	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 Mice	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
confocal laser scanning microscope	Zeiss	NA
cryostat microtome	Thermo Scientific	NA
Culture, Cap	VWR International	2005-02512
D+2:25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
Flow Analyzer	Becton Dickinson	NA
glass beads	Sigma	Z273627
Miniprep, plasmid	Promega	A1220
orbital shaking water bath	New Brunswick Innova	NA
PCR purification	QIagen	28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plate reader	Tecan	NA
Precellys 24 homogenizer	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Restriction Enzymes	New England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase	New England BioLabs	E6300L
Sanger Sequencing	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero clear tissue freezing medium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
Syringe, Filter	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Tryptic Soy Broth	VWR	90000-376
UV-visible spectrophotometer	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500