포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

Summary

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

Abstract

클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 시스템 세균성 적응 면역에 자연스럽 게 작동 하지만 성공적으로 많은 다른 살아있는 유기 체에 있는 게놈 엔지니어링에 대 한 용도가 변경 되었습니다. 가장 일반적으로, CRISPR wildtype 관련 9 (Cas9) 또는 Cas12a endonuclease 게놈, DNA 이중 가닥 휴식 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 또는 상 동 감독 수리 (를 통해 복구 후에 특정 사이트를 쪼개 다 하는 데 사용 됩니다. HDR) 통로 기증자 서식 파일 인지에 따라 결 석 또는 각각 제시. 날짜 하려면, 다른 세균 종에서 CRISPR 시스템 게놈 포유류 세포에서 편집을 수행 할 수 표시 되었습니다. 그러나, 기술의 명백한 단순에도 불구 하 고 여러 설계 매개 변수 필요 간주, 종종 그들의 게놈 편집 실험 수행에 최고의 방법에 대 한 당황 하 게 하는 사용자를 떠나. 여기, 우리가 원하는 DNA 수정, 편집 하는 포유류 세포에 실험 하는 게놈의 성공적인 실행을 촉진의 목표를 수행 하는 세포 클론의 식별에 실험적인 디자인의 완벽 한 워크플로우를 설명 합니다. 우리는 사용자의를 위한 주요 고려 사항 선택 CRISPR 시스템, 공백 길이 그리고 단일 가닥 oligodeoxynucleotide (ssODN) 기증자 서식 파일의 디자인을 포함 하 여 강조 표시 합니다. 우리는이 워크플로 유전자 녹아웃 연구, 모델링 노력, 질병에 대 한 도움이 될 것입니다 또는 기자 생성 세포 라인을 구상.

Introduction

어떤 생명체의 게놈 엔지니어링 능력은 많은 생물 의학 및 바이오 응용 프로그램, 질병 발생의 수정 같은 돌연변이, 질병 연구에 대 한 정확한 휴대 전화 모델의 건설 또는 농업 생성 바람직한 특성을 가진 작물입니다. 세기의 차례 이후 다양 한 기술 개발 되었으며, meganucleases^,12,3을 포함 한 포유류 세포에서 게놈 엔지니어링, 아연 손가락 nucleases^4,5또는 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs)^6,7,,89. 그러나, 이러한 이전 기술을 어려운 프로그램 또는 조립, 지루한 연구 및 업계에서 광범위 하 게 채택 함으로써 방해.

최근 몇 년 동안에는 클러스터 된 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced-CRISPR 관련 (Cas) 시스템 엔지니어링 기술^10,11강력한 새로운 게놈으로 떠오르고 있다. 원래 박테리아에 적응 면역 체계, 되었습니다 성공적으로 식물과 동물, 인간을 포함 한 게놈 수정에 대 한 배포. CRISPR-Cas 같은 짧은 시간에 너무 많은 인기를 얻고 있다 왜 주된 이유 주요 Cas endonuclease, Cas9 또는 Cas12a (Cpf1 라고도 함) 등을 제공 하는 요소, 게놈에 있는 정확한 위치는 단순히 공상 단일 가이드 RN의 짧은 조각 (SgRNA), A는 디자인을 간단 하 고 저렴 한 합성. 대상 사이트에 보충 되 고, 후 Ca 효소 분자가 위 한 쌍으로 하 고 그것의 RuvC, 트, 또는 Nuc 도메인^12,,1314바인딩된 DNA를 앞. 결과 두 배 좌초 휴식 (DSB)은 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 또는 상 동 감독 수리 (HDR) 통로 통해 세포에 의해 연속적으로 복구 됩니다. 복구 서식 파일의 부재, DSB 단백질 코딩 유전자에 frameshift 돌연변이 일으키는 잠재적으로 야기할 수 있는 난수 삽입 또는 삭제 컷된 사이트에 뉴클레오티드 (indels), 오류가 NHEJ 통로 의해 수리는. 그러나, 원하는 DNA 변화를 포함 하는 기증자 템플릿을, 존재 DSB 고화질 HDR 통로 의해 수리는. 기증자 서식 파일의 일반적인 종류 단일 가닥 oligonucleotides (ssODNs) 및 플라스 미드 포함 됩니다. 전 반면 후자는 일반적으로 사용 하나 비교적 긴 시퀀스를 삽입 하고자 하는 경우 원하는 DNA 변경 (예: 단일 기본적인 쌍의) 작은 경우에 일반적으로 사용 됩니다 (예를 들어 녹색 형광 단백질의 코딩 순서 또는 GFP) 대상 장소에.

Cas 단백질의 endonuclease 활동 대상 사이트¹⁵에 protospacer 인접 한 모티프 (PAM)의 존재를 요구 한다. Cas9의 팸은 protospacer의 3′ 끝에는 PAM의 Cas12a (Cpf1 라고도 함)는 5′ 끝에 대신 하는 동안¹⁶. Cas-가이드 복잡 한 RNA는 PAM은¹⁷에 결 석 하는 경우는 DSB 소개 하 수 없습니다. 따라서, PAM 특정 Ca nuclease 쪼개 다 수가 게놈 위치에 제약 조건을 배치 합니다. 다행히, 다른 세균 종에서 Cas nucleases 일반적으로 다른 팸 요구를 전시 한다. 따라서, 우리의 엔지니어링 도구 상자에 다양 한 CRISPR Cas 시스템을 통합, 우리는 게놈에 타겟이 될 수 있습니다 사이트의 범위를 확장할 수 있습니다. 또한, 자연 Ca 효소 설계 수 있습니다 또는 대체 팸 시퀀스, 게놈 목표 조작^18,,1920에 액세스할 수의 범위를 더욱 확대 인식 진화.

여러 CRISPR Cas 시스템 게놈 기술 설계 목적을 위해 사용할 수 있지만, 기술의 대부분의 사용자는 여러 이유로 주로 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 nuclease에 의존 했습니다. 첫째,이 상대적으로 단순히 NGG 팸, 더 복잡 한 PAMs 존재만 쪼개 다 수 다른 많은 Ca 단백질 달리 필요 합니다. 둘째, 인간의 세포^21,,2223,24에 성공적으로 배포 하는 첫 번째 Ca endonuclease 이다. 셋째, SpCas9까지 날짜에 최고의 특징이 효소 이다. 연구자 다른 Cas nuclease 사용 하고자 하는 경우 그 또는 그녀가 종종 것 디자인 실험 및 다른 효소 SpCas9에 비해 다른 생물학 문맥에서 얼마나 잘 수행 하는 최선의 방법에 대 한 명확한.

다른 CRISPR Cas 시스템의 상대적인 성능에 선명도 제공 하려면 우리 최근 포도 상 구 균 (SaCas9), 에서 Cas9 효소에서에서 Cas9 효소 5 개의 Ca endonucleases-SpCas9의 체계적인 비교를 수행 했습니다. Neisseria meningitidis (NmCas9) (AsCas12a)에 Acidaminococcus sp. BV3L6에서에서 Cas12a의 효소 및 Cas12a 효소 Lachnospiraceae 박테리아 ND2006에서에서 (LbCas12a)²⁵. 공정한 비교를 위해 우리는 다른 실험 조건 및 대상 사이트의 동일한 세트를 사용 하 여 다양 한 Cas nucleases 평가. 연구 또한 delineated 디자인 매개 변수 각 CRISPR Cas 시스템 기술의 사용자를 위한 유용한 참고 자료 역할을. 여기, 더 나은 CRISPR Cas 사용 하도록 연구 활성화 시스템, 다른 Cas9 및 Cas12a 효소 ( 그림 1참조)로 최적의 게놈 엔지니어링에 대 한 단계별 프로토콜 제공. 프로토콜 뿐만 아니라 포유류 세포에서 게놈 성공적인 엔지니어링 결과의 가능성을 최대화 하기 또한 중요 한 디자인 고려 하지만 실험 내용을 포함 합니다.

그림 1 : 게놈을 생성 하는 워크플로 개요 편집 인간의 세포 라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

1입니다. sgRNAs의 디자인 적절 한 CRISPR-Cas 시스템을 선택 합니다. 첫째, 모든 Cas9 및 Cas12a nucleases 포유류 세포16,21-32에 작동 표시 되어의 팸 시퀀스에 대 한 대상 영역을 검사 합니다. 5 자주 사용된 효소 그들의 각각 PAMs 함께 표 1 에 주어진 다.참고: 외는 endonucleases 성공적으로 배포 된 포유류 세포 뿐만 아니라, 연쇄 상 구 균 thermophilus (St1Cas9)에서 Cas9 nuclea…

Representative Results

실험, 관심 소재 시 복제 될 필요가 타겟팅 sgRNA 표현 CRISPR 플라스 미드를 편집 하는 게놈을 수행 합니다. 첫째, 플라스 미드는 그것을 선형화 하는 제한 효소 (일반적으로 타입 IIs 효소)로 소화 된다. 완전 하 고 부분 소화 사이 구별 하는 소화 되지 않은 플라스 미드와 함께 1 %agarose 젤에 소화 제품을 확인 하는 것이 좋습니다. 소화 되지 않은 플라스 미드는 supercoiled, 그들은 선형화 (참조 <strong class=…

Discussion

CRISPR-Cas 시스템 엔지니어 유전자 및 식물 및 동물의 transcriptomes 강력 하 고 혁신적인 기술입니다. 많은 세균성 종의 게놈 및 transcriptome 목적⁴⁴엔지니어링에 대 한 적응 수 있습니다 CRISPR Cas 시스템을 포함 하도록 발견 되었습니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 endonuclease은 배포할 성공적으로 인간 세포^21,22,,…

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.