Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser
Summary
Il successo di un esperimento di cristallografia risolti in tempo ai femtosecondi seriale dipende dalla consegna efficiente dei campioni. Qui, descriviamo protocolli per ottimizzare l’estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin da un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. La metodologia si basa sull’omogeneizzazione del campione con un romanzo accoppiatore di tre vie e la visualizzazione con una telecamera ad alta velocità.
Abstract
Iniettori di micro-estrusione ad alta viscosità hanno ridotto drasticamente il consumo del campione nel serial femtosecond cristallografici esperimenti (SFX) al laser a elettroni liberi a raggi x (XFELs). Una serie di esperimenti utilizzando la batteriorodopsina pompa protonica luce-driven ulteriormente hanno stabilito questi iniettori come un’opzione preferita di consegnare cristalli per risolti in tempo ai femtosecondi seriale cristallografia (TR-SFX) risolvere le modifiche strutturali del proteine dopo fotoattivazione. Per ottenere più strutturali istantanee di alta qualità, è essenziale per raccogliere grandi quantità di dati e garantire la liquidazione dei cristalli tra ogni impulso del laser di pompa. Qui, descriviamo in dettaglio come abbiamo ottimizzato l’estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin per i nostri esperimenti di TR-SFX risale alle origine Linac della luce coerente (LCL). L’obiettivo del metodo è quello di ottimizzare estrusione per un flusso stabile e continuo, mantenendo un’alta densità di cristalli per aumentare il tasso a cui i dati possono essere raccolti in un TR-SFX sperimentare. Raggiungiamo questo obiettivo attraverso la preparazione di fase lipidica cubico con una distribuzione omogenea dei cristalli utilizzando una siringa di tre vie romanzo dispositivo seguito regolando la composizione del campione sulla base di misurazioni della stabilità dell’estrusione scattate con un’alta velocità di attacco installazione della telecamera. La metodologia può essere adattata per ottimizzare il flusso di altri microcristalli. L’installazione sarà disponibile per gli utenti del nuovo stabilimento svizzero Free Electron Laser.
Introduction
Seriale a femtosecondi cristallografia (SFX) è una tecnica di biologia strutturale che sfrutta le proprietà uniche dei raggi x laser ad elettroni liberi (XFEL) per determinare le strutture di temperatura ambiente da migliaia di cristalli di dimensioni micrometriche mentre outrunning la maggior parte delle il danno da radiazione della “diffrazione prima distruzione” principio1,2,3.
In un’estensione di tempo-risolta di SFX (TR-SFX), gli impulsi a femtosecondi dal XFEL sono utilizzati per studiare i cambiamenti strutturali in proteine4,5. La proteina di interesse viene attivata con un laser ottico (o un’altra attività trigger) appena prima di essere ripresi da XFEL in un’installazione di pompa-sonda. Controllando con precisione il ritardo tra gli impulsi di pompa e sonda, la proteina dell’obiettivo possa essere catturata in Stati diversi. Film molecolare dei cambiamenti strutturali nel corso di undici ordini di grandezza in tempo dimostrare il potere delle nuove fonti XFEL per studiare la dinamica di diverse proteine target6,7,8,9, 10,11,12,13. Principalmente, il metodo unisce le tecniche strutturali con spettroscopiche e statiche dinamiche in uno, fornendo un assaggio nelle dinamiche di proteina a vicino a risoluzione atomica.
Sistemi semplici per TR-SFX possono contenere un trigger endogeno di attivazione con un componente fotosensibile come retinica bacteriorhodopsin (bR)9,10, i cromofori nel fotosistema II12,13, proteina gialla fotoattivi (PYP)6,7 reversibilmente fotomodulabili proteina fluorescente11, o un monossido di carbonio photolyzable in mioglobina8. Emozionanti varianti della tecnica ancora in fase di sviluppo si basano su mix e iniettare schemi14,15 per studiare le reazioni enzimatiche o un campo elettrico usato per indurre cambiamenti strutturali16. Dato che fonti XFEL sono rese disponibili solo per pochi anni e l’estrapolazione successi del passato verso il futuro, il metodo Mostra il potenziale come un vero e proprio gioco-changer rispetto alla nostra comprensione di come funzione di proteine.
Perché campioni biologici sono distrutti da una singola esposizione a un’ad alta potenza impulso XFEL, nuovi approcci alla cristallografia di proteine erano necessari. Tra queste procedure, la capacità di crescere grandi quantità di microcristalli uniforme doveva essere sviluppato17,18,19. Per abilitare la raccolta di dati a un XFEL, questi cristalli devono essere consegnati, scartati e poi rinnovati per ogni impulso XFEL. Dato che XFELs fuoco utilizzabili impulsi a 10-120 Hz, consegna del campione deve essere veloce, stabile e affidabile, mantenendo anche i cristalli intatto e limitando il consumo. Tra le soluzioni di maggior successo è un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità, che trasporta un continiously colonna della temperatura ambiente crystal-carico lipidico cubi fase (LCP) in streaming attraverso il pulsato di fascio raggi x20. Cristalli orientati casualmente, incorporate nel flusso di LCP, che vengono intercettati dallo spargimento di impulsi XFEL raggi x su un rivelatore dove si è registrato un pattern di diffrazione. LCP è stata una scelta naturale per un mezzo di consegna del campione, poiché viene frequentemente utilizzata come mezzo di crescita per membrana proteina cristalli17,21,22,23, ancora altri supporti informatici di alta viscosità 24,25,26,27,28,29,30 e31 di proteine solubili sono stati utilizzati anche nell’iniettore. SFX con l’iniettore ad alta viscosità è riuscita durante la determinazione della struttura della membrana proteine13,32 compreso il G proteina-ha accoppiato i ricevitori (GPCR)33,34, 36, 35,37, con qualità di dati sufficiente per nativo phasing38,39 pur essendo esempio efficiente e tempo. Attualmente, questi iniettori vengono utilizzati più ordinariamente per misure di temperatura al sincrotrone fonti28,30,40,41 , così come durante il più tecnicamente esigente esperimenti TR-SFX a XFELs9,10,13,42.
Esperimenti di TR-SFX paragonabili sono stati effettuati utilizzando altri tipi di iniettori come fase liquida consegna in un flusso concentrato di ugello6,7,12, tuttavia, questo metodo richiede una quantità di proteina non è disponibile per molti biologicamente interessanti destinazioni. Per la determinazione delle strutture statiche mediante estrusione viscoso un consumo medio di 0,072 mg di proteina per diffrazione 10.000 indicizzate rispetto alle 9,35 mg per il getto di liquido ugelli sono stati segnalati (cioè circa 130 volte più campione efficiente)20. L’iniettore ad alta viscosità ha dimostrato di essere un dispositivo di consegna campione valido per TR-SFX mentre solo sacrificare alcuni di questo esempio efficienza43. In Nogly et al (2018)10, ad esempio, il consumo del campione era circa 1,5 mg per 10.000 modelli indicizzate, che paragona favorevole a simili esperimenti di TR-SFX utilizzando il PYP dove il consumo medio del campione era molto più alto con 74 mg di proteina per 10.000 indicizzata modelli6. Iniettori ad alta viscosità sono così evidenti vantaggi quando sta limitando la quantità di proteina disponibile o quando cristalli sono coltivati direttamente in LCP.
Per TR-SFX utilizzando ad alta viscosità iniettori a cedere i dati più affidabili diversi problemi tecnici devono essere affrontate: la velocità di flusso deve rimanere sopra un minimo valore critico; la hit-rate dovrebbe essere mantenuta ad un livello che non esegue il rendering lento di raccolta di dati (ad es., superiore al 5%); e campione deve essere consegnato senza eccessive interruzioni. Idealmente, questi requisiti sono già soddisfatti molto prima che un esperimento di TR-SFX pianificato per utilizzare il tempo disponibile XFEL efficientemente come possibile. Primis, un rallentamento del flusso di LCP può permettere di cristalli che sono stati attivati con più di un impulso laser ottico e risultato in Stati attivi misti di sondaggio sondaggio materiale pompato quando umpumped materiale è previsto nel fascio. Un ulteriore vantaggio dell’iniezione pre-test è che i tempi di inattività durante la raccolta di dati presso un XFEL è ridotta a icona come tempo relegato alla sostituzione ugelli intasati, cambiando i campioni non-espulsione, e altre attività di manutenzione è ridotto.
Qui, presentiamo un metodo per ottimizzare la consegna del campione per la raccolta di dati di TR-SFX con un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. Per semplicità, i metodi descritti non si basano sull’accesso ad una sorgente di raggi x, anche se lavoro presso un sincrotrone beamline29 sarebbe fornire ulteriori informazioni sui tassi di successo previsti e diffrazione di cristallo. I nostri protocolli sono stati sviluppati per ottimizzare gli esperimenti per catturare isomerizzazione retinica nella pompa protonica bacteriorhodopsin10 e sono svolte in due fasi a partire con la preparazione dei campioni di cristallo per estrusione seguita monitorando l’estrusione utilizzando un programma di installazione di telecamere ad alta velocità. Nella prima fase, il LCP carichi di cristallo è mescolato con ulteriori LCP, lipidi di transizione bassa temperatura o altri additivi per garantire che la miscela finale è adatta per il recapito nell’ambiente campione senza intasamento o rallentando. Un nuovo coupler siringa a tre vie è stato sviluppato per migliorare la miscelazione omogeneità delle prestazioni e del campione. La seconda fase è costituito da una prova di estrusione registrata da una telecamera ad alta velocità per misurare direttamente la stabilità di velocità di estrusione. In seguito all’analisi dei dati video, possono effettuare regolazioni per il protocollo di preparazione del campione per migliorare i risultati sperimentali. Queste procedure possono essere adattate per preparare altre proteine per la raccolta di dati di TR-SFX, con modifiche minime e contribuiranno all’uso efficiente delle limitate XFEL valutazione. Con nuove strutture XFEL appena iniziando la loro operazione44,45 e il trasferimento dei metodi di raccolta dati seriale basata su iniettore a sincrotroni28,30,40,41 , nei prossimi anni saranno sicuramente continuerà a fornire emozionanti nuove intuizioni le dinamiche strutturali di una gamma sempre più ampia di bersagli proteici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di TR-SFX con l’iniettore di estrusione viscoso ha dimostrato di essere una tecnica valida per gli studi di dinamica strutturale di bacteriorhodopsin9,10 e fotosistema II13 e ora sembra pronto a studiare proteine guida altro processi biologici foto ad esempio trasporto di ioni luce-driven o percezione sensoriale5,50. I protocolli descritti sopra sono stati progettati per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo Gebhard Schertler, Rafael Abela e Chris Milne per sostenere l’uso di iniettori ad alta viscosità allo PSI. Richard Neutze e il suo team sono riconosciuti per le discussioni sulla cristallografia risolta in tempo e consegna del campione usando gli iniettori ad alta viscosità. Sostegno finanziario, riconosciamo la Swiss National Science Foundation per sovvenzioni 31003A_141235, 31003A_159558 (a J.S.) e PZ00P3_174169 (a P.N.). Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di innovazione nell’ambito della sovvenzione Marie Sklodowska-Curie accordo No 701646 e ricerca Orizzonte 2020 dell’Unione europea.
Materials
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
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