Verhaltensweisen für den Studierenz-Stress in Zebrafischen

Summary

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache Methode, um Stress verhaltensverhaltensverhaltensverhaltensverhaltensverhaltensfrei bei erwachsenen Zebrafischen zu messen. Der Ansatz nutzt die angeborene Tendenz, dass Zebrafische die untere Hälfte eines Tanks bevorzugen, wenn sie sich in einem stressigen Zustand befinden. Wir beschreiben auch Methoden zur Kopplung des Assays mit der Pharmakologie.

Abstract

Eine angemessene Reaktion auf stressige Reize ist für das Überleben eines Organismus unerlässlich. Es wurden umfangreiche Untersuchungen zu einem breiten Spektrum von stressbedingten Erkrankungen und psychiatrischen Erkrankungen durchgeführt, dennoch sind weitere Studien zur genetischen und neuronalen Regulierung von Stress erforderlich, um bessere Therapeutika zu entwickeln. Der Zebrafisch stellt ein starkes genetisches Modell zur Untersuchung der neuronalen Untermauerungen von Stress dar, da es eine große Ansammlung von Mutanten und transgenen Linien gibt. Darüber hinaus kann die Pharmakologie leicht auf Zebrafische angewendet werden, da die meisten Medikamente direkt dem Wasser zugesetzt werden können. Wir beschreiben hier die Verwendung des “neuartigen Panzertests” als Methode, um angeborene Stressreaktionen bei Zebrafischen zu untersuchen, und zeigen, wie potenzielle Angstmedikamente mit dem Test validiert werden können. Die Methode kann leicht mit Zebrafischlinien gekoppelt werden, die genetische Mutationen beherbergen, oder solche, in denen transgene Ansätze zur Manipulation präziser neuronaler Schaltkreise verwendet werden. Der Test kann auch in anderen Fischmodellen verwendet werden. Gemeinsam sollte das beschriebene Protokoll die Annahme dieses einfachen Tests an andere Labore erleichtern.

Introduction

Stressreaktionen sind veränderte Verhaltens-und physiologische Zustände, die aus potenziell schädlichen oder mitteldurchschnittlichen Reizen resultieren. Stressreaktionen werden im gesamten Tierreich konserviert und sind entscheidend für das Überleben eines Organismus¹. Die jahrzehntelange Forschung hat unser Wissen über einige der genetischen und neuronalen Mechanismen, die den Stresszuständen zugrunde liegen, stark erweitert. Heute sind Bereiche des Gehirns wie die Amygdala und das Striatum², und genetische Faktoren wie Corticotropin freisetzendes Hormon (Crh), und die Glukokortikoid (gr) und Mineralocortikod-Rezeptoren ( Mr) wurden ausgiebig untersucht 3^{,4,5, 6.} Trotz dieser kritischen Befunde ist in Bezug auf die genetische und neuronale Regulierung von Stress noch viel unbekannt. Viele stressbedingte Störungen leiden daher unter einem Mangel an Therapeutika.

Gentechnisch veränderbare Modellorganismen bieten ein nützliches Werkzeug bei der Untersuchung der genetischen und neuronalen Verhaltenskontrolle. Vor allem Fischmodelle sind extrem leistungsfähig: Sie sind kleine Organismen mit kurzen Erzeugungszeiten, ihr Einsatz im Labor ist oberflächlich, ihre Genome leicht modifiziert, und als Wirbel teilen sie nicht nur genetische, sondern auch neuroanatomische Homologie mit ihren Säugetieren 7,8^. Standard-Assays zur Messung von Stress können mit Zebrafischlinien gepaart werden, die genetische Mutationen beherbergen, oder solche, in denen Manipulationen präziser neuronaler Untergruppen möglich sind, und die Auswirkungen einzelner Gene oder definierter Neuronen können schnell und effizient beurteilt werden.

Verhaltenell können Stressreaktionen in Fischen als Perioden der Hyperaktivität oder längere Phasen der Inaktivität (ähnlich wie “Einfrieren”) 9,reduzierte Erkundung¹⁰, schnelle Atmung, reduzierteNahrungsaufnahme 11 und eine Platzpräferenz für den Boden eines Tanks¹². Wenn zum Beispiel erwachsene Zebrafische und andere kleine Fischmodelle in einen unbekannten Tank gelegt werden, zeigen sie eine anfängliche Vorliebe für die untere Hälfte des Tanks, doch im Laufe der Zeit beginnen die Fische mit der Erkundung der oberen und unteren Hälften mit nahezu gleicher Häufigkeit¹². Die Behandlung von Erwachsenen mit Medikamenten bekannt, um Angstzustände zu reduzieren, führen dazu, dass Fische sofort die obere Hälfte^10,13zu erforschen. Umgekehrt führen Medikamente, die die Angst erhöhen, dazu, dass Fische eine starke Vorliebe für die untere Hälfte des Tanks^12,14,15zeigen. So sind reduzierte Explorationen und die Bevorzugung der unteren Hälfte des Tanks einfache und zuverlässige Indikatoren für Stress.

Wie die meisten Wirbeltiere werden auch bei Fischen die Stressreaktionen bei Fischen durch die Aktivierung der Hypothalamic-Pituitary-inter-renal-Achse (HPI; analog zur Hypothalamin-Pituitary-Adrenal-Achse bei Säugetieren)^{14,16angetrieben}. Hypothalamische Neuronen, die das Hormon Corticotropin freisetzendes Hormon (CRH) an die Hypophyse ausdrücken, das wiederum adrenocorticotropische freisetzende Hormone (ACTH) freigibt. ACTH signalisiert dann an die Internierendrüse^,Cortisol zu produzieren und zu trennen, das eine Reihe von nachgelagerten Zielen¹⁶hat, von denen eines negative Feedback der crh^{produzierenden}hypothalamischen Neuronen 3,17 ist, ^18,19.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Beurteilung von Verhaltensmaßnahmen von angeborenem Stress. Für das Verhalten werden die Protokolle mit dem neuartigen Panzertauchtest^12,14detailliert beschrieben. Wir zeigen dann als Beispiel, dass ein bekanntes Angstmedikament, Buspirone, verhaltensbedingte Stressmaßnahmen reduziert.

Protocol

Das Protokoll wurde von der Institutional Animal Care and Use Committeeat Florida Atlantic University genehmigt. 1. Vorbereitung Gestalten Sie einen isolierten Raum für Verhaltensstudien oder schließen Sie einen Teil eines Raumes, so dass er isoliert wird.Achtung: Der Raum sollte ungestört sein und wenig Verkehr haben, um ein normales Verhalten der Fische zu vermeiden. Verschieben Sie die folgenden Materialien und Geräte in den Verhaltenssaal: (i) eine Kamera und ei…

Representative Results

Stress bei Zebrafischen untersuchtUm das Stressverhalten im Laufe der Zeit bei wilden Zebrafischen zu untersuchen, haben wir im neuartigen Tanktest erwachsene Fische aus der AD-Sorte24 getestet. Ab Erwachsene wurden dem Protokoll wie oben beschrieben unterzogen. Kurz gesagt, die Fische erhielten eine 1-h-Akklimatisierung in einem Tank im Verhaltensraum. Ein Einzelner wurde für 10-min in einen Becher gelegt und dann sanft in einen ungewohnten Tank (neu…

Discussion

Zebrafische zeigen eine robuste Stressreaktion in einem neuartigen Tank
Hier beschreiben wir einen einfachen Verhaltensansatz zur Untersuchung von Stressreaktionen bei erwachsenen Zebrafischen und bestätigen den Ansatz als einfaches Maß für Stress mit Pharmakologie.

Der neuartige Panzertest ist ein weit verbreiteter Test zur Untersuchung angeborener Belastungen bei Zebrafischen und anderen Fischarten 12^,14^{, 21, 35,<…}

Materials

Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology
Buspirone chloride	Sigma-Aldrich	B7148
Randomized trial generator			We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel