Поведенческие подходы к изучению врожденного напряжения в рыбе данио
Summary
Эта рукопись описывает простой метод измерения стресса поведенчески у взрослых рыб данио. Этот подход использует врожденную тенденцию, что данио рыбы предпочитают нижней половине танка, когда в стрессовом состоянии. Мы также описываем методы связывания анализа с фармакологией.
Abstract
Реагирование надлежащим образом на стрессовые раздражители имеет важное значение для выживания организма. Обширные исследования было сделано по широкому спектру связанных со стрессом заболеваний и психических расстройств, но дальнейшие исследования в генетических и нейрональных регулирование стресса по-прежнему необходимы для разработки лучше терапии. Рыба данио дает мощную генетическую модель для исследования нервных основ стресса, так как существует большая коллекция мутантных и трансгенных линий. Кроме того, фармакология может легко применяться к рыбе данио, так как большинство препаратов могут быть добавлены непосредственно в воду. Мы описываем здесь использование “Роман танк испытаний” в качестве метода для изучения врожденных реакций стресса в данио рерио, и продемонстрировать, как потенциальные анксиолитические препараты могут быть проверены с помощью анализа. Этот метод легко может сочетаться с рыбными линиями данио, укрывательство генетическими мутациями, или теми, в которых используются трансгенные подходы для манипулирования точными нейросхемами. Анализ также может быть использован в других моделях рыбы. В совокупности описанный протокол должен способствовать принятию этого простого анализа в другие лаборатории.
Introduction
Стресс ответы изменены поведенческих и физиологических состояний в результате потенциально вредных или отрицательной стимулы. Стресс ответы сохраняются во всем животном царстве, и имеют решающее значение для выживания организма1. Десятилетия исследований значительно расширили наши знания о некоторых генетических и нейрональных механизмов, лежащих в основе стрессовых состояний. Сегодня, области головного мозга, такие как миндалины и стриатум2, и генетические факторы, такие как кортикотропин рилизинг гормон (ЦРБ), и глюкокортикоидов (гр) и минералкортикоидных рецепторов ( Mr) были подробно изучены3,4,5,6. Несмотря на эти критические выводы, многое остается неизвестным о генетическом и нейрональных регулирование стресса. Как таковой, много вызванных напряжений разладов терпят от отсутсвия терапевтики.
Генетически наменные модели организмов обеспечивают полезный инструмент в изучении генетического и нейрональных контроля поведения. Модели рыб, в частности, чрезвычайно мощные: они являются малыми организмами с коротким поколением, их использование в лабораторных условиях является поверхностным, их геномы легко модифицированы, и, как позвоночных, они разделяют не только генетические, но и нейроанатомические Гомология с их коллегами млекопитающих7,8. Стандартные анализы для измерения напряжения могут быть в паре с линиями рыб данио укрывательство генетических мутаций, или те, в которых манипуляции точных нейронных подмножеств возможно, и эффекты отдельных генов или определенных нейронов могут быть оценены быстро и эффективно.
Поведенчески, стресс ответы могут быть охарактеризованы в рыбе как периоды гипер-активности или длительных периодов бездействия (сродни “замораживания”)9, снижение разведки10, учащенное дыхание, снижение потребления пищи11, и место-предпочтение на дно танка12. Например, при помещении в незнакомый танк, рыба взрослого данио и другие мелкие рыбные модели изначально отдают предпочтение нижней половине бака, однако со временем рыба начинает исследовать верхние и нижние половинки с почти одинаковой частотой12. Лечение взрослых с наркотиками, как известно, уменьшить беспокойство вызывают рыбу сразу исследовать верхнюю половину10,13. И наоборот, препараты, которые увеличивают тревогу вызывают рыбы, чтобы показать сильное предпочтение нижней половине танка12,14,15. Таким образом, снижение разведочных работ и предпочтение нижней части бака являются простыми и надежными индикаторами стресса.
Как и большинство позвоночных, стрессовые реакции в рыбе обусловлены активацией гипоталамо-гипофизарно-межпочечной оси (ИНН; аналог гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси у млекопитающих)14,16. Гипоталамуса нейронов, выражающих гормон кортикотропин рилизинг гормон (ЦРБ) сигнал гипофиза, который в свою очередь релизы адренокортикотропиком рилизинг гормон (ACTH). ACTH затем сигналы в межпочечную железу производить и секретируют кортизола, который имеет ряд вниз по течению цели16, один из них является отрицательной обратной связи от ЦРБ-производство нейронов гипоталамуса3,17, 18,19.
Здесь мы описываем метод оценки поведенческих показателей врожденного стресса. Для поведения, мы подробно протоколы, используя новый танк Дайвинг тест12,14. Затем мы демонстрируем, как пример, что известный Анксиолитический препарат, buspirone, уменьшает поведенческие меры стресса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рерио рыбы демонстрируют надежную реакцию на стресс в романе танк
Здесь мы описываем простой поведенческий подход к изучению стрессовых реакций у взрослых рыб данио, и проверяем подход как простую меру стресса, используя фармакологию.
Новый танк тест является шир…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием из инициативы Юпитера в области науки о жизни при Флоридском Атлантическом университете до РД и АК. Эта работа была также поддержана грантами R21NS105071 (присуждены ACK и РД) и R15MH118625 (присужден Орд) от национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
References
- McEwen, B. S. Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load. Annals of the New York Academy of Sciences. 840, 33-44 (1998).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Facchinello, N., et al. Nr3c1 null mutant zebrafish are viable and reveal DNA-binding-independent activities of the glucocorticoid receptor. Scientific Reports. 7 (4371), (2017).
- Ziv, L., et al. An affective disorder in zebrafish with mutation of the glucocorticoid receptor. Molecular Psychiatry. , (2013).
- Grone, B. P., Maruska, K. P. Divergent evolution of two corticotropin-releasing hormone (CRH) genes in teleost fishes. Frontiers in Neuroscience. , (2015).
- Fuller, P. J., Lim-Tio, S. S., Brennan, F. E. Specificity in mineralocorticoid versus glucocorticoid action. Kidney International. , (2000).
- Zhdanova, I. V. Sleep and its regulation in zebrafish. Reviews in the Neurosciences. 22 (1), 27-36 (2011).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. , (2001).
- Duboué, E. R. E. R., Hong, E., Eldred, K. C. K. C., Halpern, M. E. M. E. Left Habenular Activity Attenuates Fear Responses in Larval Zebrafish. Current Biology. 27 (14), 2154-2162 (2017).
- Facchin, L., Duboue, E. R., Halpern, M. E. Disruption of Epithalamic Left-Right Asymmetry Increases Anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15847-15859 (2015).
- Øverli, &. #. 2. 1. 6. ;., Sørensen, C., Nilsson, G. E. Behavioral indicators of stress-coping style in rainbow trout: Do males and females react differently to novelty. Physiology and Behavior. , (2006).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiology & behavior. 90 (1), 54-58 (2007).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Cachat, J., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nature Protocols. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Mathuru, A. S., et al. Chondroitin fragments are odorants that trigger fear behavior in fish. Current Biology. , (2012).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: Molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. General and Comparative Endocrinology. , (2009).
- Evans, A. N., Liu, Y., MacGregor, R., Huang, V., Aguilera, G. Regulation of Hypothalamic Corticotropin-Releasing Hormone Transcription by Elevated Glucocorticoids. Molecular Endocrinology. , (2013).
- Fenoglio, K. A., Brunson, K. L., Avishai-Eliner, S., Chen, Y., Baram, T. Z. Region-specific onset of handling-induced changes in corticotropin- releasing factor and glucocorticoid receptor expression. Endocrinology. , (2004).
- Liposits, Z., et al. Ultrastructural localization of glucocorticoid receptor (GR) in hypothalamic paraventricular neurons synthesizing corticotropin releasing factor (CRF). Histochemistry. , (1987).
- Facchin, L., Duboué, E. R., Halpern, M. E. Disruption of epithalamic left-right asymmetry increases anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), (2015).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. 발생학. , (2018).
- Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 208 (2), 450-457 (2010).
- Matsunaga, W., Watanabe, E. Habituation of medaka (Oryzias latipes) demonstrated by open-field testing. Behavioural Processes. 85 (2), 142-150 (2010).
- Walker, C. Chapter 3 Haploid Screens and Gamma-Ray Mutagenesis. Methods in Cell Biology. , (1998).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2010).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39 (3), 255-261 (2006).
- Gammans, R. E., et al. Use of buspirone in patients with generalized anxiety disorder and coexisting depressive symptoms. A meta-analysis of eight randomized, controlled studies. Neuropsychobiology. 25 (4), 193-201 (1992).
- Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: A 3-D approach. Behavioural Brain Research. , (2012).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2011).
- Maximino, C., et al. Fingerprinting of psychoactive drugs in zebrafish anxiety-like behaviors. PLoS ONE. , (2014).
- Horváth, J., Barkóczi, B., Müller, G., Szegedi, V. Anxious and nonanxious mice show similar hippocampal sensory evoked oscillations under urethane anesthesia: Difference in the effect of buspirone. Neural Plasticity. , (2015).
- Costall, B., Kelly, M. E., Naylor, R. J., Onaivi, E. S. Actions of buspirone in a putative model of anxiety in the mouse. Pharm Pharmacol. 40 (7), 494-500 (1988).
- Barros, M., Mello, E. L., Huston, J. P., Tomaz, C. Behavioral effects of buspirone in the marmoset employing a predator confrontation test of fear and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2001).
- Heinen-Kay, J. L., et al. Predicting multifarious behavioural divergence in the wild. Animal Behaviour. 121, 3-10 (2016).
- Thompson, R. R. J., Paul, E. S., Radford, A. N., Purser, J., Mendl, M. Routine handling methods affect behaviour of three-spined sticklebacks in a novel test of anxiety. Behavioural Brain Research. 306, 26-35 (2016).
- Hamilton, T. J., et al. Establishing zebrafish as a model to study the anxiolytic effects of scopolamine. Scientific Reports. , (2017).
- York, R. A., Fernald, R. D. The Repeated Evolution of Behavior. Frontiers in Ecology and Evolution. 4, 143 (2017).
- Jakka, N. M., Rao, T. G., Rao, J. V. Locomotor behavioral response of mosquitofish (Gambusia affinis) to subacute mercury stress monitored by video tracking system. Drug and Chemical Toxicology. , (2007).
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. , (2018).
- Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: A critical review. Behavioural Brain Research. 214 (2), 157-171 (2010).
- Maximino, C., Marques de Brito, T., Dias, C. A. G., Gouveia, A., Morato, S. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Godwin, J., Sawyer, S., Perrin, F., Oxendine, S., Kezios, Z. Adapting the Open Field Test to assess anxiety related behavior in zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , 181-189 (2012).
- Agetsuma, M., et al. The habenula is crucial for experience-dependent modification of fear responses in zebrafish. Nature Neuroscience. 13 (11), 1354-1356 (2010).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning and Memory. , (2012).
- Baker, M. R., Goodman, A. C., Santo, J. B., Wong, R. Y. Repeatability and reliability of exploratory behavior in proactive and reactive zebrafish, Danio rerio. Scientific Reports. , (2018).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. , 7 (2013).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Marquart, G. D., et al. A 3D Searchable Database of Transgenic Zebrafish Gal4 and Cre Lines for Functional Neuroanatomy Studies. Frontiers in Neural Circuits. , (2015).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Gupta, T., et al. Morphometric analysis and neuroanatomical mapping of the zebrafish brain. Methods. 1046 (18), 30011-30012 (2018).
- Marquart, G. D., et al. High-precision registration between zebrafish brain atlases using symmetric diffeomorphic normalization. GigaScience. , (2017).
- Ronneberger, O., et al. ViBE-Z: A framework for 3D virtual colocalization analysis in zebrafish larval brains. Nature Methods. , (2012).
- Subedi, A., et al. Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis. Methods. 66 (3), 433-440 (2014).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Chatterjee, D., Tran, S., Shams, S., Gerlai, R. A Simple Method for Immunohistochemical Staining of Zebrafish Brain Sections for c-fos Protein Expression. Zebrafish. , (2015).
