Enfoques conductuales para estudiar el estrés innato en el pez cebra

Summary

Este manuscrito describe un método simple para medir el estrés de forma oral en el pez cebra adulto. El enfoque aprovecha la tendencia innata que el pez cebra prefiere la mitad inferior de un tanque cuando está en un estado estresante. También describimos métodos para acoplar el ensayo con farmacología.

Abstract

Responder apropiadamente a estímulos estresantes es esencial para la supervivencia de un organismo. Se ha realizado una extensa investigación sobre un amplio espectro de enfermedades relacionadas con el estrés y trastornos psiquiátricos, pero aún se requieren más estudios sobre la regulación genética y neuronal del estrés para desarrollar una mejor terapéutica. El pez cebra proporciona un poderoso modelo genético para investigar los fundamentos neurales del estrés, ya que existe una gran colección de líneas mutantes y transgénicas. Además, la farmacología se puede aplicar fácilmente al pez cebra, ya que la mayoría de los fármacos se pueden agregar directamente al agua. Describimos aquí el uso de la ‘ prueba de tanque de novela ‘ como un método para estudiar las respuestas de estrés innata en el pez cebra, y demostrar cómo los fármacos ansiolíticos potenciales pueden ser validados utilizando el ensayo. El método se puede acoplar fácilmente con las líneas de pez cebra que albergan mutaciones genéticas, o aquellos en los que se utilizan enfoques transgénicos para manipular circuitos neuronales precisos. El ensayo también se puede utilizar en otros modelos de peces. En conjunto, el protocolo descrito debería facilitar la adopción de este sencillo ensayo a otros laboratorios.

Introduction

Las respuestas de estrés son estados fisiológicos y conductuales alterados resultantes de estímulos potencialmente dañinos o aversivos. Las respuestas al estrés se conservan en todo el reino animal, y son fundamentales para la supervivencia de un organismo¹. Décadas de investigación han ampliado en gran medida nuestro conocimiento de algunos de los mecanismos genéticos y neuronales subyacentes Estados de estrés. En la actualidad, las áreas del cerebro, como la amígdala y el estriado², y los factores genéticos como la hormona liberadora de corticotropina (CRH) y los receptores glucocorticoides (gr) y mineralocorticoides ( Mr) se han estudiado extensamente^3,4,5,6. A pesar de estos hallazgos críticos, todavía se desconoce mucho sobre la regulación genética y neuronal del estrés. Como tal, muchos trastornos relacionados con el estrés sufren de una falta de terapias.

Los organismos modelo genéticamente modificables proporcionan una herramienta útil en el estudio del control genético y neuronal del comportamiento. Los modelos de peces, en particular, son extremadamente poderosos: son pequeños organismos con tiempos de generación corta, su uso en un entorno de laboratorio es Facile, sus genomas son fácilmente modificados, y, como vertebrados, comparten no sólo genética, sino también neuroanatómico homología con sus homólogos^demamífero^7,8. Los ensayos estándar para medir el estrés se pueden emparejar con las líneas de pez cebra que albergan mutaciones genéticas, o aquellas en las que es posible manipular subconjuntos neuronales precisos, y los efectos de genes individuales o neuronas definidas pueden evaluarse de forma rápida y eficiente.

El comportamiento, las respuestas de estrés se pueden caracterizar en el pescado como períodos de hiper-actividad o períodos prolongados de inactividad (similar a ‘ congelación ‘)⁹, reducción de la exploración¹⁰, respiración rápida, reducción de la ingesta de alimentos¹¹, y un lugar-preferencia para el fondo de un tanque¹². Por ejemplo, cuando se coloca en un tanque desconocido, pez cebra adulto y otros modelos de peces pequeños muestran una preferencia inicial para la mitad inferior del tanque, sin embargo, con el tiempo, los peces comienzan a explorar las mitades superior e inferior con la frecuencia casi igual¹². El tratamiento de los adultos con fármacos conocidos para reducir la ansiedad causa que los peces exploren inmediatamente la mitad superior^10,13. Por el contrario, los fármacos que aumentan la ansiedad causan que los peces muestren una fuerte preferencia por la mitad inferior del tanque^12,14,15. Por lo tanto, la exploración reducida y la preferencia por la mitad inferior del tanque son indicadores simples y confiables de estrés.

Como la mayoría de los vertebrados, las respuestas de estrés en los peces son impulsadas por la activación del eje hipotalámico-pituitario-inter-renal (HPI; análogo al eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal [hPa] en mamíferos)^14,16. Las neuronas hipotalámicas que expresan la hormona liberadora de corticotropina hormonal (CRH) la señal a la hipófisis, que a su vez libera la hormona liberadora adrenocorticotropa (ACTH). ACTH entonces señala a la glándula Interrenal para producir y secretar cortisol, que tiene una serie de objetivos descendentes¹⁶, uno de ellos siendo retroalimentación negativa de las neuronas hipotalámicas que producen CRH^{3,17, 18,19}.

Aquí describimos un método para evaluar las medidas conductuales del estrés innato. Para el comportamiento, detallamos los protocolos usando la nueva prueba de buceo de tanque^12,14. A continuación, demostramos, como ejemplo, que un fármaco ansiolítico conocido, la buspirona, reduce las medidas conductuales del estrés.

Protocol

El protocolo ha sido aprobado por el Comité institucional de cuidado de animales y uso de la Universidad atlántica de Florida Atlantic. 1. preparación Designe una habitación aislada para realizar estudios de comportamiento o cierre una sección de una habitación para que se aísla.Nota: la habitación debe estar sin perturbaciones y tener poco tráfico para evitar alterar el comportamiento normal de los peces. Mueva los siguientes materiales y equipos a la sala de …

Representative Results

Examinar el estrés en el pez cebraPara examinar el comportamiento del estrés a lo largo del tiempo en el pez cebra silvestre, probamos el pescado adulto de la cepa AB24 en la prueba del tanque novel. Los adultos AB fueron sometidos al Protocolo como se describió anteriormente. Brevemente, a los peces se les dio un período de aclimatación de 1-h en un tanque en la sala de comportamiento. Un individuo fue colocado en un vaso de precipitados durante …

Discussion

El pez cebra exhibe una respuesta de estrés robusta en un nuevo tanque
Aquí describimos un enfoque de comportamiento simple para examinar las respuestas de estrés en el pez cebra adulto, y validar el enfoque como una medida simple de estrés usando farmacología.

La prueba de tanque novel es una prueba ampliamente utilizada para examinar el estrés innato en el pez cebra y otras especies de peces^12,14,<sup cla…

Materials

Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology
Buspirone chloride	Sigma-Aldrich	B7148
Randomized trial generator			We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel