Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish
Summary
Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.
Abstract
Höhle Tiere liefern ein überzeugendes System zur Erforschung der Evolutionsmechanismen und genetischen Grundlagen zugrunde liegenden Veränderungen in zahlreichen komplexen Eigenschaften, einschließlich Auge Degeneration, Albinismus, Schlafmangel, Hyperphagie und sensorischen Verarbeitung. Arten von Cavefish aus der ganzen Welt zeigen eine konvergente Entwicklung der morphologischen und verhaltensbezogene Merkmale aufgrund gemeinsamer Umweltbelastungen zwischen verschiedenen Höhlensysteme. Diverse Höhle Arten wurden in der Laborumgebung untersucht. Die mexikanische Tetra, Astyanax Mexicanus, mit sehenden und blinden Formen, einzigartige Einblicke in biologischen und molekularen Prozesse, die die Entwicklung von komplexen Eigenschaften zugrunde liegen und wird gut balanciert, als eine aufstrebende Modellsystem. Während Kandidatengene reguliert die Entwicklung der vielfältigen biologischen Prozessen in A. Mexicanus identifiziert wurden, wurde die Möglichkeit zur Validierung für einzelne Gene einer Rolle beschränkt. Die Anwendung der Transgenese und Bearbeitung von Gen-Technologie hat das Potenzial, diese erhebliche Behinderung zu überwinden und die Mechanismen der Evolution komplexe Merkmale zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine andere Methode zur Bearbeitung von Genexpression in A. Mexicanus. Ansätze umfassen die Verwendung von Morpholinos, Tol2 Transgenese und gen-editing-Systeme, häufig verwendete im Zebrafisch und andere Fische Modelle Genfunktion in A. Mexicanuszu manipulieren. Diese Protokolle enthalten detaillierte Beschreibungen der zeitgesteuerten Zucht Verfahren, die Sammlung von befruchteten Eiern, Injektionen und die Auswahl von gentechnisch veränderten Tieren. Diese methodische Ansätze ermöglicht die Untersuchung der genetischen und neuronalen Mechanismen der Evolution der vielfältigen Eigenschaften in A. Mexicanus.
Introduction
Seit Darwins Origin of Species1haben Wissenschaftler gewonnen tiefe Einblicke in wie Züge als Reaktion auf definierte Umwelt- und ökologischen Druck dank Höhle Organismen2evolutionär geprägt sind. Die mexikanische Tetra, A. Mexicanus, besteht aus Augen Vorfahren “Oberfläche” Populationen, die bewohnen Flüsse in ganz Mexiko und Süd-Texas und mindestens 29 geografisch isolierten Populationen von abgeleiteten Höhle Morphs bewohnen die Sierra del Abra und andere Bereiche des nordöstlichen Mexiko3. In A. Mexicanus, einschließlich der veränderten Sauerstoffverbrauch, Depigmentierung, Verlust der Augen und veränderte Ernährung und Nahrungssuche Verhalten4,5,6wurde eine Reihe von Höhle-assoziierten Eigenschaften ermittelt, 7,8,9. A. Mexicanus präsentiert ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung von Mechanismen der konvergente Entwicklung durch eine klar definierte Evolutionsgeschichte, eine detaillierte Charakterisierung der ökologischen Umwelt und das Vorhandensein von unabhängig Höhle entwickelt Bevölkerung10,11. Viele der Höhle-abgeleitete Merkmale, die in Cavefish, einschließlich Auge Verlust vorliegen, schlafen Verlust, erhöht, Fütterung, Verlust des Schulens, Aggression, reduziert und verringert Stressreaktionen, entstanden mehrere Male durch unabhängige Ursprünge, oft unter Verwendung verschiedenen genetischen Wege zwischen Höhlen8,12,13,14,15. Dies wiederholt Evolution ist ein starker Aspekt des A. Mexicanus Systems und bieten Einblick in die allgemeinere Frage wie genetische Systeme gestört werden kann, um ähnliche Phänotypen zu generieren.
Während die Anwendung der Gentechnik für die mechanistische Untersuchung der Genfunktion in vielen Fischarten (einschließlich A. Mexicanus) begrenzt worden, bilden die jüngsten Fortschritte in der Zebrabärbling eine Grundlage für genetische Technologieentwicklung in Fisch 16,17,18,19,20. Zahlreiche Werkzeuge sind weit verbreitet im Zebrafisch, um Genexpression zu manipulieren, und die Durchführung dieser Verfahren lange standardisiert wurden. Z. B. die Injektion von Morpholino Oligos (MOs) im Einzel-Zell-Stadium selektiv RNA blockiert und verhindert Übersetzung für einen kurzen zeitlichen Fenster während Entwicklung21,22. Darüber hinaus bearbeiten von gen Ansätze, wie z. B. regelmäßig gruppierten dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nuklease (TALEN), ermöglichen die Erzeugung von definierten Löschungen oder, in einigen Fällen Einfügungen durch Rekombination in Genome19,20,23,24. Transgenese wird verwendet, um stabile Genexpression oder Funktion in einem Zelltyp spezifische Weise zu manipulieren. Das Tol2 System wird effektiv verwendet, um transgene Tiere zu erzeugen, indem coinjecting Transposase mRNA mit einem Tol2 DNA Plasmid enthält ein Transgen25,26. Das Tol2 -System nutzt die Tol2 Transposase von Medaka, stabile Keimbahn Einfügungen von transgenen construct17 zu generieren. Generierung von Tol2 transgene beinhaltet ein Plasmid enthält ein Transgen, flankiert von Tol2 Integration Websites und mRNA für Tol2 Transposase17coinjecting. Dieses System wurde verwendet, um ein Array von transgenen Linien im Zebrafisch generieren und seine Verwendung hat vor kurzem erweitert, um zusätzliche emergent Modellsysteme, einschließlich Cichliden, Killifische, der Stichling und, in jüngerer Zeit, die mexikanische Cavefish27, 28,29,30.
Während die Cavefish eine faszinierende biologische System für erhellendes Mechanismen der Eigenschaft Evolution, hat seine volle Fähigkeit als ein evolutionäres Modell nicht voll genutzt. Dies wurde teilweise aufgrund einer Unfähigkeit, genetische Manipulation und zelluläre Funktion direkt31. Kandidaten-Gene regulieren komplexe Merkmale mit quantitative Trait Loci (QTL) Studien identifiziert worden, aber die Validierung dieser Kandidatengene wurde schwer32,33,34. Vor kurzem, transiente Zuschlag mit Morpholinos, Bearbeitung mit CRISPR und TALEN Systemen und die Verwendung von Tol2gen-vermittelten Transgenese wurden verwendet, um die genetische Basis zugrunde liegt eine Reihe von Eigenschaften35,36, 37untersuchen ,38. Die Implementierung und Standardisierung dieser Techniken erlaubt für Manipulationen, die molekularen und neuronalen Grundlagen biologischer Merkmale, einschließlich der Manipulation der Genfunktion, die Kennzeichnung der definierten Zellpopulationen zu verhören und der Ausdruck des funktionalen Reporter. Während die erfolgreiche Umsetzung dieser genetischen Werkzeuge zu manipulieren-gen oder zelluläre Funktion bei emergent Modellsysteme nachgewiesen wurde, fehlen detaillierte Protokolle noch in A. Mexicanus.
A. Mexicanus kritischen Einblick in die Mechanismen der Evolution als Reaktion auf ein verändertes Umfeld und präsentieren die Möglichkeit, neuartige Gene regulieren vielfältige Merkmale zu identifizieren. Eine Reihe von Faktoren legen nahe, dass A. Mexicanus ein äußerst gefügig Modell ist für die Anwendung von etablierten genomische derzeit verfügbaren Tools in etablierten genetischen Modellen, einschließlich der Möglichkeit, Fisch in den Labors Brut Größe einfach zu pflegen, Transparenz, eine sequenzierte Genom und definierten Verhaltensstörungen Assays39. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Nutzung der Morpholinos, Transgenese und gen bearbeiten in Oberfläche und Höhle Populationen von A. Mexicanus. Die breitere Anwendung dieser Werkzeuge in A. Mexicanus ermöglicht eine mechanistische Untersuchung der molekularen Prozesse zugrunde liegen die Entwicklung von Entwicklungsstörungen, physiologischen und verhaltensbezogenen Unterschiede zwischen Cavefish und Oberfläche Fischen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir eine Methodik für die Manipulation der Genfunktion mit Morpholinos, CRISPR/Cas9 gen bearbeiten und Transgenese Methodik. Der Reichtum der Gentechnologie und der Optimierung dieser Systeme im Zebrafisch ermöglicht es wahrscheinlich für die Übertragung dieser Werkzeuge in A. Mexicanus mit Leichtigkeit52. Neueste Erkenntnisse haben diese Ansätze in A. Mexicanusverwendet, aber sie bleiben nicht ausgelastete bei der Untersuchung der vielfältigen morphologischen, E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken für ihre Unterstützung bei der Genotypisierung und imaging der oca2 mutierte Fische in Abbildung 2dargestellten Sunishka Thakur. Diese Arbeit wurde durch die National Science Foundation (NSF) 1656574, A.C.K, NSF Award 1754321, j.k. und A.C.K, und National Institute of Health (NIH) Award R21NS105071 A.C.K und E.R.D. unterstützt.
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
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