נבג ספיחה כמערכת התצוגה Nonrecombinant אנזימים ו אנטיגנים
Summary
פרוטוקול זה מתמקד בשימוש של נבגי חיידקים ככלי nanobiotechnological “חי” כדי לספוח את מולקולות heterologous עם פעילויות ביולוגיות שונות. המפה מראה גם השיטות כדי למדוד את היעילות של ספיחה.
Abstract
הנבג החיידק הוא תא סמויה השבתה הדרגתית, שהוקמה על ידי סדרה של שכבות ההגנה המקיפה של הציטופלסמה מיובש. מבנה משונה זה גורם הנבג יציב ועמיד מאוד והציע את השימוש הנבג כפלטפורמה להצגת מולקולות heterologous. עד כה, מגוון רחב של אנטיגנים ואנזימים הוצגו על נבגים של Bacillus subtilis ושל כמה מינים אחרים, בתחילה על ידי בגישה רקומביננטי ואז, בשיטה nonrecombinant פשוטה ויעילה. מערכת התצוגה nonrecombinant מבוסס על ספיחה ישירה של מולקולות heterologous על פני השטח נבג, הימנעות הבנייה של זנים רקומביננטי על שחרורו של חיידקים מהונדסים לסביבה. מולקולות הספוחה התייצב, מוגן על ידי האינטראקציה עם נבגים, אשר מגביל את ההתדרדרות המהירה של אנטיגנים ואובדן של פעילות אנזים-התנאים שלילי. ברגע מנוצל, אנזימים נבג-הספוחה ניתן לאסוף בקלות עם ירידה מזערית של פעילות ולהשתמש בהם שימוש חוזר לביקור נוסף תגובה. נייר זה מוצג כיצד לספוח מולקולות דגם מטוהרים נבגים של B. subtilis, כיצד להעריך את היעילות של ספיחה וכיצד לאסוף את הנבגים בשימוש כדי למחזר אותם לתגובות חדשות.
Introduction
מערכות התצוגה מכוונים הצגת מולקולות פעילים ביולוגית על פני השטח של מיקרואורגניזמים ומציאת יישומים במגוון רחב של שדות, מן התעשייה כדי מנרב רפואיות וסביבתיות. בנוסף phages1,2 תאים שונים גראם שליליים וחיוביים – מינים3,4,5,6,7, נבגי חיידקים היו גם מערכות התצוגה כפי שהוצע על ידי שתי גישות8,9.
בגלל המבנה המיוחד שלה, כלומר הציטופלסמה מיובש מוקף על ידי סדרה של שכבות ההגנה10, הנבג מספקת מספר יתרונות על פני phage תא מבוססות התצוגה מערכות8,9. יתרון ראשון מגיע קיצוני החוסן והיציבות של נבגים על תנאי זה יהיה ברישול על כל שאר התאים10,11. אנטיגנים מוצגים נבג ואנזימים יציבים לאחר שהוארך אחסון בטמפרטורת החדר12 ולהגן עליהם מפני השפלה ב pH נמוך, טמפרטורות גבוהות13. יתרון נוסף של נבגים זה הביטחון של מינים רבים להיוות נבג. B. subtilis, נולד ב- clausii, נולד ב- coagulans, מספר מינים אחרים משמשים ברחבי העולם כמו פרוביוטיקה, היו בשוק לשימוש אדם או בעלי חיים במשך עשרות שנים14,15. רשומה בטיחות יוצאת דופן זו היא ברורה הדרישה כללי מערכת התצוגה משטח והיא הרלוונטיות, כאשר המערכת מיועדת לשימוש אדם או בעלי חיים16. שלישית, יתרון חשוב של מערכת התצוגה המבוסס נבג הוא כי אין לו מגבלות עבור הגודל המולקולה שצריך להיות חשופים. במערכות מבוססות phage, חלבון heterologous גדול עשוי להשפיע על המבנה capsid, בעוד מערכות מבוססות תא, זה עלול להשפיע על המבנה של הקרום או עשוי להגביל/לפגום ממברנה רוברטסונית שלב17. שכבות ההגנה המקיפה הנבג מורכב של חלבונים שונים יותר מ 7010 והם גמיש מספיק כדי לקבל חלבונים זרים גדולים ללא כל פגם מבנית ניכרת או תיפקודי8. בנוסף, עם שתי מערכות תצוגה מבוססי נבג, רוברטסונית ממברנה של החלבון heterologous אינו נדרש8,9. אכן, חלבונים heterologous או המיוצר בציטופלסמה אמא תא, התאספו על הנבג היא יצירת בציטופלסמה אותו או הספוחה8,ספורה בוגר9.
נבג התצוגה הושג בתחילה על ידי פיתוח מערכת גנטית להנדס את השטח נבג18. מערכת גנטית זו התבססה על אני) הבנייה של שילוב גנים בין קידוד גנטי את חלבון המעיל נבג (משמש כנשא) את קידוד גנטי החלבון להיות מוצג – הנוכחות של גנים ברמת השעתוק והתרגום מאותת אנדוגני ג’ין ישלוט הביטוי של פיוז’ן, ו- ii) שילוב של הגן chimeric על כרומוזום ה- B. subtilis להעניק יציבות גנטית. מגוון רחב של אנטיגנים ואנזימים הוצגו על ידי גישה זו רקומביננטי, שימוש שונים נבג פני שטח חלבונים נשאים, מכוון יישומים אפשריים שונים, החל חיסון הרירית biocatalyst, ביוסנסור, למצבה או כלי וביו-אנליטיות וואלידציה8,13.
לאחרונה, גישה שונה של תצוגת נבג כבר מפותחת19. המערכת השנייה היא nonrecombinant וכן על ספיחה ספונטנית, הדוק ביותר של מולקולות על פני השטח ספורה9. אנטיגנים19,20 ואנזימים13,21 הוצגו בצורה יעילה ו חשפו כי שיטה זו היא באופן משמעותי יעיל יותר האחד רקומביננטי. גישה nonrecombinant זו מאפשר את התצוגה של חלבונים ב- טופס מקורי20 , יכול לשמש גם עם בלוק, מוות נבגים19. מנגנון מולקולרי של ספיחה יש לא מלא הובהרו עדיין. את מטען שלילי, את hydrophobicity של הנבג הוצעו כמאפיינים הרלוונטיים עבור ספיחה13,19,22. לאחרונה, הוכח כי חלבון מודל, החלבון autofluorescent אדום (mRFP) של קורל Discosoma, כאשר הספוחה כדי הנבג, הצליחה לחדור דרך שכבות פני ההתאמה לשפות אחרות המעיל הפנימי23. אם הוכחו כנכונות חלבונים אחרים, לוקליזציה פנימי של החלבונים heterologous יכול להסביר את יציבות מוגברת כאשר הספוחה נבגים23.
במחקר שנערך לאחרונה, שני אנזימים ותזרז שני שלבים רצופים של הנתיב השפלה xylan הוצגו באופן עצמאי על נבגים של B. subtilis , כאשר מודגרות יחד, היו מסוגלים לבצע שני צעדים של השפלה21. נבגים שנאספו לאחר התגובה היו עדיין פעיל, יכולים להמשיך השפלה xylan על התוספת של המצע טריים21. גם אם הפסד של 15% של המוצר הסופי נצפתה ב התגובה השנייה21, שימושית של אנזימים הספוחה לתגובות יחיד, וכן רב שלבי, היא יתרון חשוב נוסף של מערכת התצוגה נבג.
פאן ואח24 דיווח גישה נוספים להצגת חלבונים heterologous על פני השטח נבג: חלבונים heterologous (חלבון endoglucanase ובטא-galactosidase אחד) המיוצר בתא אמא במהלך הנבגה היו באופן ספונטני עטוף במעיל נבג ויוצרים, ללא הצורך של הספק. מערכת תצוגה זו נבג נוספים היא שילוב של שתי הגישות שתוארו עד כה. אכן, זה רקומביננטי מאז החלבונים heterologous היו מהונדסים לבוא לידי ביטוי בתא אמא במהלך הנבגה, בזמן ההרכבה שלהם בתוך המעיל היה ספונטני ו, לכן, nonrecombinant24. עם זאת, היעילות של התצוגה של גישה זו נוספים נשאר להיות נבדק, לעומת שתי הגישות אחרים באמצעות אותם חלבונים heterologous.
בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל את תהליכי הייצור נבג, טיהור, אשר היו תיאר בהרחבה במקום אחר24. זה כולל התגובה ספיחה, הערכת היעילות של ספיחה על ידי מיקרוסקופ דוט-סופג, זריחה, וכן מיחזור של אנזימים הספוחה עבור התגובה נוספים סיבובים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה ספיחה נבג הוא פשוט וברור מאוד. התגובה תלויה אך ורק ה-pH של המאגר התגובה ונמצא היעילות של ספיחה אופטימלית על ערכי pH חומצי (pH 5.0 או נמוכים יותר). ב- pH ניטראלי תנאים, היעילות של ספיחה נמוכה, על ערכי pH אלקליין, ספיחה עלולים להופיע. ספיחה אופטימלית מתקבל באמצעות אמצעי אחסון של µL 200 1.5 mL צינ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי “Finanziamento di החיפוש אחר di Ateneo” כדי ל’ Baccigalupi, כותרת פרוייקט “SP-LAY: בקטריאלי נבגים כפלטפורמה חיה לתצוגה חלבונים”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
