Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей
Summary
Этот протокол определяет экспериментальной процедуры характеризовать геном-изменения в уровнях столб-поступательные изменения гистона (ПТМ), возникающих в связи с гиперэкспрессия белков, связанные с ALS и болезни Паркинсона в Saccharomyces cerevisiae модели. После разъединения SDS-PAGE отдельные гистона PTM уровни концентрации обнаружены с модификации специфические антитела через западный blotting.
Abstract
Нейродегенеративные заболевания, такие как боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD), приводят к потере сотен тысяч жизней каждый год. Хватает эффективного лечения может остановить прогрессирование болезни. Несмотря на обширные последовательности в больших популяциях пациентов в большинстве случаев ALS и PD остаются необъяснимые, генетические мутации в одиночку. Эпигенетики такие механизмы, как столб-поступательные изменения гистона белков, могут быть вовлечены в этиологии нейродегенеративных заболеваний и прогрессии и привести к новые цели для фармацевтических вмешательства. Млекопитающих в vivo и in vitro модели ALS и PD являются дорогостоящими и зачастую требует длительных и трудоемких экспериментальных протоколов. Здесь мы приводим практический, быстрой и экономически подход к определению генома общесистемной изменения гистона модификации уровней с помощью Saccharomyces cerevisiae как модель системы. Этот протокол позволяет для всеобъемлющего расследования эпигеномные изменения, подключенных к нейродегенеративных proteinopathies, что подтверждают ранее сделанные выводы в различных модельных системах значительно расширяя наши знания о нейродегенеративные заболевания epigenome.
Introduction
Нейродегенеративные заболевания являются разрушительных болезней с практически нет доступных вариантов лечения. Среди них особенно страшны боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD). Примерно в 90% случаев ALS и PD считаются спорадические, происходящие без семейной истории болезни, в то время как оставшиеся дела работать в семьях и как правило связаны с конкретным ген мутации1,2. Интересно, что оба этих заболеваний связаны с белком mislocalization и агрегации3,4,5,6. К примеру, сливается в саркома (FUS) и TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43) являются белки, связывающие РНК mislocalize в цитоплазму и объединяют в ALS7,8,9,10, 11,12, в то время как α-synuclein — это компонент принципа белковых агрегатов, называется Леви органов в PD5,13,14,15.
Несмотря на обширные генома всей ассоциации в больших популяциях пациентов подавляющее большинство случаев ALS и PD оставаться необъяснимая генетически. Можно эпигенетики играть определенную роль в нейродегенеративных заболеваний? Эпигенетики включает в себя изменения в экспрессии генов, происходит без изменения базовой последовательности ДНК16. Основные эпигенетический механизм включает столб-поступательные изменения (PTMs) гистоновых белков16. В эукариотических клетках генетический материал плотно завернута в хроматина. Базовой единицей хроматина является нуклеосома, состоящий из 146 пар оснований ДНК, обернутые вокруг гистона octamer, состоящий из четырех пар гистонов (две копии каждого гистонами H2A, H2B, H3 и H4)17. Каждый гистона имеет N-терминальный хвост, который выступает из нуклеосомой и может быть изменена путем добавления различных химических постановление, обычно на остатков лизина и аргинина18. Эти PTMs являются динамическими, что означает, что они могут быть легко добавлены и удалены и включают группы ацетилирования, метилирование и фосфорилирования. PTMs контролировать доступность ДНК транскрипционный анализ техники и тем самым помочь управления ген выражение18. К примеру, ацетилирование гистона уменьшает силы электростатического взаимодействия между очень основные гистона белка и отрицательно заряженной ДНК позвоночника, позволяя гены, Упакованные ацетилированный гистонами быть более доступным и, таким образом высоко выраженная19. Совсем недавно замечательный биологических специфику конкретных гистона PTMs и их комбинаций привела к гистона кода гипотеза20,21 в котором белки, писать, стереть и чтение гистон PTMs все согласованно действовать для модулировать экспрессию генов.
Дрожжей является очень полезной моделью для изучения нейродегенеративные. Важно отметить, что многие нейрональных клеточных пути сохраняются из дрожжей для людей22,,2324. Дрожжи пилки цитотоксичность фенотипы и белковых включений по гиперэкспрессии FUS, TDP-43 или α-synuclein22,23,24,25,26. В самом деле Saccharomyces cerevisiae модели ALS были использованы для выявления генетических факторов риска в людей27. Кроме того дрожжи, экспрессирующих человека α-synuclein разрешено для характеристики сети Rsp5 как druggable цель улучшения α-synuclein токсичности в нейроны28,29.
Здесь мы описываем протокол эксплуатации Saccharomyces cerevisiae для выявления генома wide гистонов PTM изменения, связанные с нейродегенеративных proteinopathies (рис. 1). Использование S. cerevisiae весьма привлекательными из-за его простоту использования, низкая стоимость и скорость по сравнению с другими in vitro и животных моделей нейродегенеративные. Использование ранее разработан ALS и PD модели22,23,25,26, мы оверэкспрессировали человека FUS, TDP-43 и α-synuclein в дрожжей и открытые собственный гистона PTM изменения, происходящие в связь с каждой proteinopathy30. Протокол, который мы описываем здесь может быть завершена в менее чем за две недели от преобразования для анализа данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь обеспечивает простой, целесообразным и экономически эффективным способом изменения генома wide гистонов ПТМ, коррелирует с нейродегенеративных proteinopathies классификации. Хотя есть другие модели ALS и PD, например в vitro линий клеток человека и мышиным модели<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Royena Tanaz, Юсуф Худа и Sadiqa Taasen для получения технической помощи. Мы очень благодарны профессор Джеймс короче за щедрое предоставление реагентов и интеллектуальной помощи в разработке сахарозы настройки экспериментов. Плазмиды дрожжи были щедрый подарок от профессор Аарон Gitler (включая 303 Гал-Фу; Плазмиды # 29614 Addgene). Бруклинский колледж и расширенный научно исследовательский центр (КЮНИ), а также низ NINDS Advanced докторской перехода награду (K22NS09131401) поддержал M.P.T.
Materials
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M. Parkinson’s Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson’s disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. 신경과학. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
