Dyrking av grønne mikroalger boble kolonnen Photobioreactors og analysen for nøytral lipider

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å konstruere lab skala boble kolonnen photobioreactors og bruke dem til kultur mikroalger. Det gir også en metode for bestemmelse av kultur vekst og nøytrale lipid innhold.

Abstract

Det er betydelig interesse i studiet av mikroalger for tekniske applikasjoner som produksjon av biodrivstoff, høy verdi produkter, og for behandling av avfall. Som de fleste nye forskningsinnsats begynner på laboratoriet skala, er det behov for kostnadseffektive metoder for dyrking av mikroalger på en reproduserbar måte. Her kommuniserer vi en effektiv tilnærming til kultur mikroalger i laboratoriet skala photobioreactors, og å måle vekst og nøytrale lipid innhold av at alger. Instruksjonene finnes også på hvordan du setter opp photobioreactor systemet. Selv om eksempel organismene Chlorella og Auxenochlorella, kan dette systemet tilpasses for å dyrke en rekke mikroalger, inkludert co kulturer av alger med ikke-alger arter. Lager kulturer dyrkes først i flasker for å produsere inoculum for photobioreactor-systemet. Alger inoculum er konsentrert og overført til photobioreactors for dyrking i satsvis modus. Eksempler er samlet daglig for optisk densitet målingene. På slutten av batch kultur, celler er høstet av sentrifuge, vasket, og fryse tørket å få en endelig tørrvekt konsentrasjon. Siste tørrvekt konsentrasjonen brukes til å lage en sammenheng mellom optisk densitet og tørr vekt konsentrasjonen. En modifisert Folch metode brukes deretter til å hente totalt lipider fra frysetørket biomasse og ekstrakt er assayed for sin nøytrale lipid innhold ved hjelp av en microplate analysen. Denne analysen er publisert tidligere, men protokollen skritt ble tatt her for å markere viktige trinnene i fremgangsmåten hvor ofte oppstår. Bioreactor systemet beskrevet her fyller en nisje mellom enkel kolbe dyrking og fullt kontrollert kommersielle bioreactors. Selv med bare 3-4 biologiske replikerer per behandling, vår tilnærming til dyrking alger fører til tett standardavvik i vekst og lipid analyser.

Introduction

Anvendelsen av mikroalger i ingeniørfag og bioteknologi har tiltrukket stor interesse i de senere år. Mikroalger blir undersøkt for bruk i avløpsvann behandling^1,2,3,4, biodrivstoff produksjon^5,6,7,8, og produksjon av nutraceuticals og andre høy verdi produkter^9,10. Alger er også genetisk endres til høyere priser i et forsøk på å forbedre deres egnethet for bestemte tekniske programmer^11,12. Dermed er det stor interesse eksperimentering med industrielt relevante organismer i kontrollerte innstillinger. Formålet med denne metoden er å kommunisere effektiv tilnærming til kultur mikroalger i et kontrollert laboratoriemiljø og måle vekst og nøytrale lipid innhold av at alger. Forbedre vekst priser og nøytrale lipid innhold av mikroalger har blitt identifisert som to viktige flaskehalser mot kommersialisering av alger biodrivstoff¹³.

En rekke tilnærminger har blitt brukt til kultur alger for eksperimentelle formål. Generelt, kan disse metodene deles mellom store utendørs dyrking og småskala innendørs dyrking. Utendørs dyrking i photobioreactors og åpne dammer er egnet for eksperimentering å skalere opp prosesser som er allerede påvist i laboratoriet skala (f.eks å teste skalaen opp av en ny høy-lipid stamme av alger)¹⁴. Men innendørs småskala dyrking er egnet når utvikle nye eller forbedrede alger stammer eller utføre eksperimenter sikte på å forstå biologiske mekanismer. I disse siste tilfellene, er en høy grad av eksperimentelle kontroll nødvendig å tease ut subtile endringer i biologisk atferd. Derfor, er axenic kulturer ofte nødvendig for å minimere de komplekse biotiske faktorene assosiert med andre organismer (f.eks bakterier, andre alger) som uunngåelig vokse i store utendørs systemer. Selv når studere interaksjoner mellom alger og andre organismer, har vi funnet at bruk av svært-kontrollerte eksperimentelle forhold er nyttig når undersøke molekylær utveksling mellom organismer^15,16,17.

Innenfor kategorien av småskala innendørs Algedyrking har en rekke tilnærminger brukt. Kanskje er den mest brukte metoden å dyrke alger i Erlenmeyer flasker i en shaker tabell under en lys bank^18,19. Utveksling av oksygen og CO₂ foregår ved passiv spredning gjennom en skum plugg i toppen av flasken. Noen forskere har forbedret dette oppsettet gjennom aktiv lufting av flasker²⁰. En annen tilnærming er å dyrke alger på flasker, mikset av rør bar og aktive lufting. Til tross for sin enkelhet, har vi funnet at bruk av kolber og flasker fører ofte til inkonsekvente resultater blant biologiske gjentak. Antagelig dette skyldes posisjon effekter – forskjellige posisjoner motta ulike mengder av lys, som også påvirker interne reaktoren temperaturer. Daglig rotasjon av reaktorer til nye plasseringer kan hjelpe, men ikke avhjelpe problemet fordi visse stadier av alger vekst (f.eks tidlig eksponentiell) er mer følsomme for posisjonelle effekter enn andre (f.eks Logg fase).

På motsatt side av spekteret av teknologisk raffinement er fullstendig kontrollert kommersielle photobioreactors. Disse systemene kontinuerlig overvåke og justere forhold i reaktoren å optimalisere algene oppblomstringen. De har programmerbare belysning, sanntid temperaturkontroll og pH-kontroll. Dessverre de er dyre og vanligvis koster flere tusen dollar per reaktoren. Mest vitenskapelige og tekniske tidsskrifter krever biologiske replikering av resultater, nødvendiggjør kjøp av flere bioreactors. Vi presenterer her en boble kolonnen reaktoren system som broer skillet mellom enkel (kolbe) og sofistikert (fullt kontrollert bioreactor) tilnærminger for lab skala Algedyrking. Boble kolonnene bruker stigende gassboblene å lette gassutveksling og bland reaktoren. Denne tilnærmingen gir en viss grad av kontroll over lys og temperatur, men gjør det på en måte som er kostnadseffektiv. Videre har vi funnet dette systemet å gi svært konsekvente resultater blant biologiske gjentak, redusere antall biologiske gjentak nødvendig for å få statistisk signifikante resultater sammenlignet med kolbe eller flaske tilnærming. Vi har også brukt dette systemet til vellykket dyrke blandinger av alger og bakterier²¹. I tillegg til Algedyrking skissere vi en prosedyre for å måle nøytral lipid innholdet i kulturperler alger. Sistnevnte har vært publisert andre steder²², men vi inkluderer fremgangsmåten her for å gi trinnvise instruksjoner for hvordan du bruker den med hell.

Protocol

1. oppsett av boble kolonnen Photobioreactors Konstruere en rekke ventilerte dekslene fra plast dekslene som kom med 1 L glassflasker og hybridisering rør (se figur 1 for skjematisk og bilder). Konstruere lokk luftfukter, blande felle, hver air lift photobioreactor og hver flaske reaktoren. Bore ¼” hull i lokket: 2 hull er nødvendig for bioreactor og luftfukter lokk; 3 hull er nødvendig for miksing fellen. Ta en ¼” O-ring over trådene av en 1/8†panel m…

Representative Results

Denne prosedyren gir en gang løpet av alger optisk tetthet data på OD 550 nm (figur 4A). Optisk tetthet og tørr vekt konsentrasjon data kan være korrelert (figur 4B). Dette oppnås ved første beregning av den endelige tørrvekt alger konsentrasjonen etter fryse-tørking trinn. Neste, den optiske densitet for kultur føljetong fortynning (utføres på den siste dagen av sampling) og de faktiske tørrvekt konsentrasjonene kan …

Discussion

Det viktigste hensynet når dyrking alger er en forståelse av behovene til organisme eller gruppe organismer. Algene dyrking systemet beskrevet her kan brukes å kulturen en rekke alger men bestemte abiotiske faktorer (temperatur, media, pH, lysintensitet, CO₂ -nivå, lufting rate) må justeres for organismen. Merk parameterne som beskrives her ble brukt til dyrking av Chlorella og Auxenochlorella. Disse organismene er industrielle interessante fordi de er tolerante høyt næringsinnhold, ly…

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles	Corning	16157-191	For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp	Home Depot	UC953A	or equivalent
1/4" female luer to barb	Nordson biomedical	Nordson FTLL360-6005	1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-244	50'
1/4" in O-rings	Grainger	1REC5	#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb	Nordson biomedical	FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-608	250'
1/8" male spinning luer to barb	Nordson biomedical	MLRL013-6005
1/8" multiport barb	Nordson biomedical	4PLL230-6005	1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb	Nordson biomedical	18230-6005	1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer	Nordson biomedical	Nordson MLRLB230-6005	1/8", PP
10 gallon fish tank	Walmart	802262	Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter	Dwyer	RMA-13-SSV	For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank	Agrobrite	FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-14-SSV	For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles	Corning	16157-136	For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-12-SSV	For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter	Dwyer	RMA-151-SSV	For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm	Whatman/ Fisher	09-745-1A	Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves	VWR	89094-714
Corning lids for pyrex bottles	VWR	89000-233	10 GL45 lids
Female luer endcap	Nordson biomedical	Nordson FTLLP-6005	Female stable PP
Hybridization tubes	Corning	32645-030	35×300 mm, pack of 2
Light timer	Walmart	556393626
Locknuts	Nordson biomedical	Nordson LNS-3	1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer	VWR	10153-690	Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap	Nordson biomedical	Nordson LP4-6005	Male plug PP
Spinning luer lock ring	Nordson biomedical	Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long	VWR	58949-040	38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium	VWR	58949-034	25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters	VWR	28145-491	13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes	Air-tite	89215-216	For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes	VWR	87003-294	Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes	Greiner Bio-One	82050-482	Sterile (or equivalent)
100 mm plates	VWR	25384-342	100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-276	Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips	Greiner Bio-One	82051-584	Sterile (or equivalent)
2 mL tubes	VWR	87003-298	Sterile (or equivalent)
50 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-348	Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate	Greiner Bio-One	89089-578	Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops	VWR	80094-478	Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator	Airgas	CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes	VWR	10158-556	Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates	Greiner Bio-One	82050-774	Polypropylene, flat bottom
Bleach	Walmart	550646751	Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform	BDH	BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol	BDH	BDH1133-1LP
Methanol	BDH	BDH20864.400
Nile red	VWR	TCN0659-5G
Pasteur pipette tips	VWR	14673-010
Sodium chloride	BDH	BDH9286-500G
Vegetable oil	Walmart	9276383	Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)	Biospec products	11079105z
Equipment
Analytical balance	Mettler-Toledo	XS205DU	Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer	Omni	19-040E
Benchtop micro centrifuge	Thermo	Heraeus Fresco 21 with 24×2	Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater	VWR	75838-282	Including dry block for a microplate
Freeze dryer	Labconco	7670520	2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge	Thermo	Heraeus Megafuge 16R Tissue	Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer	VWR	10153-838