Summary

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Published: May 23, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Abstract

Acute graft-versus-host ziekte (GVHD) is een significante beperking voor patiënten die hematopoietische stamceltransplantatie ondergaan als therapie voor Hematologische tekortkomingen en maligniteiten. Acute GVHD treedt op wanneer donor cellen gastheer weefsels als een vreemd antigeen herkennen en een immuunrespons op de host monteren. Huidige behandelingen omvatten toxische immunosuppressieve geneesmiddelen die patiënten vatbaar voor infectie en herhaling. Zo, er is lopend onderzoek naar een acute GVHD therapie die effectief kan richten op donor T cellen en het verminderen van bijwerkingen. Veel van dit pre-klinische werk maakt gebruik van de xenogene GVHD (xenoGVHD) Murine model dat het mogelijk maakt voor het testen van immunosuppressieve therapieën op menselijke cellen in plaats van murene cellen in een in vivo systeem. Dit protocol schetst hoe xenoGVHD te induceren en hoe te blind en standaardiseren klinische scoring om consistente resultaten te garanderen. Daarnaast wordt in dit protocol beschreven hoe u digitale PCR gebruikt om menselijke T-cellen in muizen weefsels te detecteren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van geteste therapieën te kwantificeren. Het xenoGVHD-model biedt niet alleen een model om GVHD-therapieën te testen, maar elke therapie die menselijke T-cellen kan onderdrukken, die vervolgens kan worden toegepast op veel ontstekingsziekten.

Introduction

Allogene hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) is een routine behandeling geworden voor patiënten die lijden aan hematologische maligniteiten zoals leukemie met een slechte prognose. Een significante complicatie van HSCT is acute graft-versus-hostziekte (GVHD). In een 2012-studie werd gemeld dat acute GVHD werd ontwikkeld in 39% van de HSCT-patiënten die transplantaties kregen van broer of zus en 59% van de patiënten die transplantaties ontvingen van niet-verbonden donoren1. Acute GVHD treedt op wanneer de donor afkomstige T-cellen de organen van de geadresseerde aanvallen. De enige succesvolle therapie voor GVHD is behandeling met zeer immunosuppressieve geneesmiddelen2, die zeer giftig en verhogen het risico van infectie en tumor herhaling. Zo, ondanks verbeteringen die zijn aangebracht in acute gvhd overleving in de afgelopen jaren3,4,5, er is nog steeds een kritische behoefte aan verbeterde gvhd therapieën met minimale toxiciteit die op lange termijn remissie bevorderen.

Het algemene doel van de volgende methoden is om te induceren en te scoren xenogene GVHD (xenoGVHD). De xenoGVHD model werd ontwikkeld als een instrument voor het opwekken van acute GVHD met menselijke cellen in plaats van Murine cellen waardoor meer directe vertaling van pre-klinisch GVHD onderzoek naar klinische proeven6. Dit model omvat het intraveneus injecteren van humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) muizen die sublethaal bestraald zijn. Geïnjecteerde humane t-cellen worden geactiveerd door humane antigeen-presentatie cellen (apc’s) die muriene antigeen vertonen en de geactiveerde T-cellen migreren naar verre weefsels resulterend in systemische ontstekingen en uiteindelijk overlijden6,7, 8 , 9 , 10. ziekte pathologie en progressie in het xenogvhd model nabootsen van menselijke acute gvhd. In het bijzonder zijn de pathogene menselijke T-cellen reactief naar Murine Major histocompatibility complex (MHC) eiwitten, die vergelijkbaar is met de T-cel alloreactivity in humaan gvhd6,9. Het belangrijkste voordeel van de xenoGVHD model over de muis MHC-mismatch model, de andere veel gebruikte GVHD model, is het mogelijk voor het testen van therapieën op menselijke cellen in plaats van Murine cellen. Dit maakt het testen van producten die direct kunnen worden vertaald naar de kliniek zonder enige wijzigingen, omdat ze zijn gemaakt om menselijke cellen te richten. Onlangs is dit model gebruikt om een humaan anti-Il-2 antilichaam11, humane Thymus regulatoire T-cellen (tregs)12 en humane mesenchymale stamcellen13 te testen als mogelijke behandelingen voor acute gvhd. In een bredere context kan dit model worden gebruikt als een in-vivo-onderdrukkings test voor elk medicijn of celtype dat menselijke T-celactiviteit kan onderdrukken. Stockis et al.14 gebruikte bijvoorbeeld het xenoGVHD-model om het effect te bestuderen van het blokkeren van integrine αvβ8 op Treg suppressieve activiteit in vivo. Het xenoGVHD-model kan dus inzicht geven in het mechanisme van elke therapie gericht op T-cellen in een in vivo-instelling.

Een aanvullende methode die in dit protocol wordt beschreven, is het detecteren van menselijke T-cellen in muis weefsels met behulp van digitale polymerase kettingreactie (dPCR). Het doel van deze methode is om een instrument aan te bieden om migratie en proliferatie van T-cellen in doelweefsels te kwantificeren, die de werkzaamheid van immunosuppressieve therapieën meten die in dit model worden getest. dPCR is een relatief nieuwe methode voor de kwantificering van nucleïnezuren15. In het kort wordt het PCR-reactiemengsel onderverdeeld in partities die kleine aantallen van de doel volgorde of helemaal geen doel bevatten. De doel volgorde wordt vervolgens versterkt en gedetecteerd met behulp van DNA-intercalciserende kleurstoffen of fluorescerende doelspecifieke sondes. dpcr kwantificeert het aantal kopieën van de doel volgorde op basis van de Fractie van positieve partities en de statistieken van Poisson15,16. Het opsporen van T-cellen met dPCR vereist veel minder weefsel dan andere alternatieve methoden, waaronder Flowcytometrie en histologie, en kan worden uitgevoerd op bevroren of vast weefsel. dPCR vereist geen standaard curve om de Kopieer nummers te bepalen, noch zijn technische replicaten vereist. Dit vermindert de hoeveelheid reagens en het template-DNA die nodig zijn voor dPCR in vergelijking met traditionele kwantitatieve PCR (qPCR)16. Het partitioneren van de PCR-reactie in subreacties in dPCR concentreert zich doeltreffend op doelen17. Zo is dPCR in de eerste plaats een hulpmiddel voor het opsporen van zeldzame doelen in een grote hoeveelheid niet-doelwit DNA. Bijvoorbeeld, dPCR wordt gebruikt voor het opsporen van bacteriële besmetting in melk18, identificeren zeldzame mutaties in de oestrogeen receptor Gene19, en detecteren CIRCULEREND tumor-DNA in het bloed van patiënten20. In dit protocol fungeert dPCR als een efficiënt hulpmiddel voor het opsporen en kwantificeren van menselijke T-cellen in weefsels van muizen met xenoGVHD.

Protocol

Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming, en met goedkeuring van, de Universiteit van Kansas Medical Center institutionele dierenverzorging en gebruik Comité. Alle gezonde menselijke bloedmonsters werden verkregen onder geïnformeerde toestemming en met goedkeuring van de institutionele Review Board aan de Universiteit van Kansas Medical Center. 1. bestraling van NSG-muizen Een dag voorafgaand aan PBMC injectie, bestralen 8 – 12 weken oude NSG muizen (beide gesl…

Representative Results

Sublethally bestraalde 8-12-week oude NSG-muizen van beide geslachten die menselijke PBMC ontvingen begonnen met het weergeven van klinische symptomen van GVHD rond dag 10 na injectie in vergelijking met negatieve controle muizen die alleen PBS ontvingen (Figuur 1a). XenoGVHD muizen hadden een mediane overleving van 23,5 dagen (Figuur 1b). Met digitale PCR kunnen CD3 Epsilon positieve menselijke T-cellen worden gedetecteerd in de…

Discussion

Ziekteprogressie is over het algemeen consistent in het xenoGVHD-model, zelfs met een injectie van PBMC van verschillende donoren, zodat meerdere experimenten kunnen worden gecombineerd. De belangrijkste stappen die nodig zijn om deze consistentie te behouden, zijn goede i.v.-injectietechniek, blindering en consistente scoring. Een studie van Nervi et al.25 toonde aan dat in vergelijking met intraveneuze staart ader injectie, retro-orbitale injecties van PBMC resulteerden in een consistentere engr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen graag het laboratorium van Lane Christenson erkennen voor het leveren van de digitale PCR-machine die wordt gebruikt in deze experimenten en voor de geleverde technische ondersteuning. Ook willen we Dr. Thomas Yankee bedanken voor zijn begeleiding en mentorschap. Deze studies werden ondersteund door de Tripp Family Foundation.

Materials

1.5 mL eppendorf tubes Fisher 05-408-129
10 mL serological pipet VWR International 89130-898
10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin Becton Dickinson 366480
250 µL Ranin pipette tips Rainin 17001118 Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube VWR International 89039-656
96-Well ddPCR plate Bio-Rad 12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer Lonza 10-548E Optional
Alcohol Wipes Fisher Scientific 6818
Anesthesia Chamber World Precision Instruments EZ-178 Provided by animal facility
Anesthesia Machine Parkland Scientific PM1002 Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set Becton Dickinson 367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator Bio-Rad 1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O Life Technologies 1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology Sigma-Aldrich E7023-500ML
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Ficoll Fisher Scientific 45001750
Insulin Syringe Fisher Scientific 329424
Isoflurane Sigma-Aldrich CDS019936 Provided by animal facility
Liquid nitrogen N/A N/A
Mouse Irradiator Pie Cage Braintree Scientific, Inc. MPC 1 Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") Fisher Scientific 19-027-761
P1000 pipetman MidSci A-1000
P200 pipetman MidSci A-200
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad 1814040
Pipetaid Gilson Macroman Fisher Scientific F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805 Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69506
qPCR plates VWR International 89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System Bio-Rad 12001925 Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen Bio-Rad 1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix Bio-Rad 1864033
RNase and DNase-free plate seal Thermo Scientific 12565491
RPMI Advanced 1640 Life Technologies 12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) Fisher Scientific 67522
Sterile Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 21040CV
Sterile reservoir VWR International 89094-662
Surgial Scissors Kent Scientific INS600393-4
Surgical Forceps Kent Scientific INS650914-4

References

  1. Jagasia, M., et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation. Blood. 119 (1), 296-307 (2012).
  2. Bolanos-Meade, J., et al. Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802. Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).
  3. Gooley, T. A., et al. Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
  4. Hahn, T., et al. Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).
  5. Khoury, H. J., et al. Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era. Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).
  6. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical & Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  7. Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells. Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).
  8. Ito, R., et al. Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice. Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).
  9. Kawasaki, Y., et al. Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).
  10. Ito, R., et al. A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8. T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).
  11. Trotta, E., et al. A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism. Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).
  12. Dijke, I. E., et al. Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells. American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).
  13. Huang, F., et al. Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals. Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).
  14. Stockis, J., et al. Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).
  15. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  16. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
  17. Sykes, P. J., et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
  18. Ma, H., et al. Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR. Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).
  19. Vitale, S. R., et al. An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA. Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).
  20. Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies. Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).
  21. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  23. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).
  24. Weisdorf, D. J., et al. Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).
  25. Nervi, B., et al. Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice. Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).
  26. Leon-Rico, D., et al. Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice. LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).
  27. Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype. PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).
  28. van Rijn, R. S., et al. A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice. Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).
  29. Wunderlich, M., et al. OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues. Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).
  30. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).
  31. Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?. Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).

Play Video

Cite This Article
Seng, A., Markiewicz, M. A. Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR. J. Vis. Exp. (147), e59107, doi:10.3791/59107 (2019).

View Video