Vev forberedelse og Immunostaining av mus Kraniofacial vev og Undecalcified Bone
Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å oppdage og kvantifisere proteinnivåer under kraniofacial morphogenesis/patogenesen av immunostaining ved hjelp av musen kraniofacial vev som eksempler. I tillegg beskriver vi en metode for utarbeidelse og kryosnitt av undecalcified harde vev fra unge mus for immunostaining.
Abstract
Tissue immunostaining gir svært spesifikk og pålitelig påvisning av proteiner av interesse innenfor et gitt vev. Her beskriver vi en komplett og enkel protokoll for å oppdage protein uttrykk under kraniofacial morphogenesis/patogenesen ved hjelp av mus kraniofacial vev som eksempler. Protokollen består av utarbeidelse og kryosnitt av vev, indirekte immunofluorescence, bildeoppkjøp, og kvantifisering. I tillegg er en metode for utarbeidelse og kryosnitt av undecalcified hardt vev for immunostaining beskrevet, ved hjelp av kraniofacial vev og lange bein som eksempler. Disse metodene er nøkkelen til å bestemme protein uttrykk og morfologiske/anatomiske endringer i ulike vev under kraniofacial morphogenesis/patogenesen. De gjelder også for andre vev med passende modifikasjoner. Kunnskap om histologi og høy kvalitet på seksjoner er avgjørende for å trekke vitenskapelige konklusjoner fra eksperimentelle utfall. Potensielle begrensninger av denne metodikken inkluderer men er ikke begrenset til spesifisitet av antistoffer og vanskeligheter med kvantifisering, som også diskuteres her.
Introduction
Ansiktet er en viktig del av menneskets identitet, og er sammensatt av flere forskjellige typer vev, som epitel, muskler, bein, brusk, tann. Disse vev er avledet fra alle tre bakterie lag: ektoderm, endoderm, og mesoderm1,2. For riktig mønster og utvikling av kraniofacial vev, celle spredning, død og differensiering må være svært koordinert og regulert av spesifikke signalering veier, for eksempel wnt, FGF, HH og BMP trasé3,4 ,5. Defekter i spredning, overlevelse eller differensiering av celler vil føre til kraniofacial misdannelser, som er blant de hyppigst forekommende medfødte misdannelser. Transgene mus er nyttige verktøy for å studere mekanismer for kraniofacial morphogenesis og patogenesen1,2,3,4,5. Forstå endringene i kraniofacial strukturer under utvikling og patogenesen vil bidra til å avklare viktige utviklingsmessige prinsipper samt mekanismer for kraniofacial misdannelser1,2,3 ,4,5.
Den farging av hele montere eller delt vev med spesifikke antistoffer er en uvurderlig teknikk for å bestemme romlig fordeling av proteiner av interesse 6. Formelt kan vevs immunostaining stole enten på immunhistokjemi (IHC) eller immunofluorescence (IF). Sammenlignet med den ugjennomsiktige reaksjons produkt generert med et kromogen substrat som 3, 3 ‘-Diaminobenzidine (DAB) med IHC, hvis innebærer bruk av fluorescerende konjugater synlig ved fluorescens mikroskopi. Derfor, hvis kan tydelig skille positive celler fra bakgrunnsstøy, og lar bildene skal kvantitativt analysert og forbedret på en enkel måte av programvare som ImageJ og Adobe Photoshop7,8. Hele Mount farging tilnærmingen fungerer på små blokker av vev (mindre enn 5 mm tykk), som kan gi tredimensjonal informasjon om plasseringen av proteiner/antigener uten behov for rekonstruksjon fra avsnitt9,10 . Men sammenlignet med vev seksjoner, hele Mount immunostaining er tidkrevende og krever store mengder antistoff løsninger. Ikke alle antistoffer er kompatible med den grunnleggende hele monterings tilnærmingen. I tillegg vil ufullstendig inntrengning av antistoffer føre til ujevne flekker eller falske negative flekker. Her vil vi fokusere på immunofluorescence deteksjon av proteiner/antigener på delt vev. For hardt vev (f. eks, hode, tann, lange ben), kalsium avsetning under utvikling/patogenesen gjør prøven vanskelig å delen og lett skylles av under immunostaining behandling11,12. De fleste av de tilgjengelige protokollene avkalke hard vev før innebygging for å gjøre snitting enklere, noe som er tidkrevende og kan ødelegge morfologi og antigener av prøver hvis håndteres feil11,12. For å overkomme problemene, optimaliserte vi en tilnærming for kryosnitt av hardt vev uten Avkalking, noe som fører til forbedret visualisering av deres morfologi og distribusjon av signalering proteiner.
Protokollen som beskrives her, brukes til å bestemme morphometric og histologiske endringer i det kraniofacial vevet i BMP transgene mus. Nærmere bestemt inkluderer protokollen (1) høsting og dissekere hodet vev, (2) seksjon og immunostaining av eksperimentelle markører (Ki67, pSmad1/5/9) sammen med TUNEL farging, (3) Imaging avsnittene ved hjelp av fluorescens mikroskop, og til slutt (4) analysere og kvantifisere resultatene. Protokollen til å forberede og cryosection hardt vev uten avkalking er også beskrevet13. Disse metodene er optimalisert for kraniofacial vev. De er også gjeldende for andre vev fra ulike aldre av prøver med passende modifikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her gir vi en detaljert protokoll for utarbeidelse av mus hodet og undecalcified bein vev, og kryosnitt for immunostaining av celle spredning, celle død, og BMP signalering markører. Vi har også detaljert informasjon om strategien for innhenting av kvantitative data fra immunofluorescent bilder. Disse metodene kan også gjelde for andre vev med passende modifikasjoner.
Betingelser for vevs forberedelser varierer etter størrelse og type vev. Fiksering og cryoprotection tid vanligvis trenger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01DE020843 til Y.M.), International FOP Association (Y.M.), og en stipend-i-bistand fra National Natural Science Foundation i Kina (31500788 til J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
