Method Article

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

DOI:

10.3791/59113

⸱

May 10th, 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서, 우리는 마우스 두개안면 조직을 사용하여 면역 염색에 의해 두개안면 형태 형성/병인 동안 단백질 수준을 검출하고 정량화하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 면역 염색을 위한 젊은 마우스에게서 decalcified 되지 않은 단단한 조직의 준비 그리고 저온 절제를 위한 방법을 기술합니다.

Abstract

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조직 면역 염색은 주어진 조직 내의 관심 있는 단백질의 고도로 특이하고 믿을 수 있는 검출을 제공합니다. 여기에서 우리는 예를 들면 마우스 두개안면 조직을 사용하여 두개안면 형태 형성/병인 도중 단백질 발현을 검출하는 완전하고 간단한 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 조직의 준비 및 냉동 부피, 간접 면역 형광, 이미지 수집 및 정량화로 구성됩니다. 또한 면역 염색을위한 비해짐 경조직의 준비 및 냉동 절제 방법은 두개안면 조직과 긴 뼈를 예로 들수 있습니다. 그 방법은 두개안면 형태 형성/병인 동안 다양한 조직에서 단백질 발현 및 형태학적/해부학적 변화를 결정하는 데 핵심적인 것입니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 그밖 조직에 적용가능합니다. 연구 결과에 대한 지식과 섹션의 높은 품질은 실험 결과에서 과학적 결론을 도출하는 데 중요합니다. 이 방법론의 잠재적 한계는 항체의 특이성 및 정량화의 어려움에 한정되지 않으나, 이는 또한 여기에서 논의된다.

Introduction

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얼굴은 인간 정체성의 중요한 부분이며 상피, 근육, 뼈, 연골, 치아와 같은 여러 가지 유형의 조직으로 구성됩니다. 그 조직은 모든 3개의 세균 층에서 파생됩니다: ectoderm, 내배엽및 중배엽 1,2. 두개안면 조직의 적절한 패터닝 및 개발을 위해서는 Wnt, Fgf, Hh 및 Bmp 경로3,4와 같은 특정 신호 경로에 의해 세포 증식, 사망 및 분화가 고도로 조정되고 조절되어야 합니다. ,5. 세포의 증식, 생존 또는 분화의 결함은 가장 자주 발생하는 선천성 선천성 선천적 인 결함 중 하나 인 두개안면 기형으로 이어질 것입니다. 형질전환 마우스는 두개안면 형태 형성 및 병인의 메커니즘을연구하는 데 유용한 도구1, 2,3,4,5.

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Protocol

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모든 마우스 실험은 연구에서 동물의 인도적 관리 및 사용을 다루는 미시간 대학 지침에 따라 수행되었다. 이 연구에서 사용된 모든 동물 절차는 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 #PRO00007715).

1. 조직 준비

  1. 배아 조직의 준비
    1. 10cm 접시 1개, 인산완충식염수(PBS)를 함유한 3.5cm 접시 1개, 임신한 마우스마다 PBS에 2 mL 4% 파라포름알데히드(PFA)가 들어있는 12웰 배양 플레이트 1개를 준비한다. 모든 페트리 요리와 접시를 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 연기 후드에 4% PFA를 처리합니다.
    2. 앞서 설명한 바와 같이 집게와 가위로 얼음 차가운 PBS에서 임신 한 마우스에서 배아를 해부14.
      1. 간단히, CO2로 임신 마우스를 안락사, 집게로 배의 중심 아래 피부를 잡고 피부를 통해 잘라, 다음 부드럽게 기본 복근 벽에서 분리 피부를 당겨.
      2. 다음으로, 피부 절개의 동일한 라인을 따라 복강으로 잘라. 배아의 문자열을 포함하는 자궁을 제거하고 자궁 벽....

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Results

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배아 두개안면 조직 섹션
상기 단계에 따라, 머리는 배아의 날(E) 16.5 또는 18.5에서대조군(P0-Cre)또는 돌연변이체(신경 문장 세포에서 Bmpr1a, P0-Cre; caBmpr1a)에서배아를 해부하였다. 4 시간 동안 4 % PFA에 고정 한 후, 샘플을 OCT에 내장하고 코로나절하였다. 결과된 절편은 프로토콜에 따라 항원 검색 없이 pSmad1/5/9(다운스트림 BMP 신호 인자) 또는 Ki67(세포 증식 마커)에 대한 항체로 면역화되었다. 도시된 바와 같이, pSmad1/5/9 (도1A)및 Ki67 (그림1C)은대조군 배아의 정면 뼈에서 양성이었다. 돌연변이 배아에서, pSmad1/5/9의 수준이 증가하였다 (그림1B),Ki67의.......

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Discussion

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여기에서 우리는 마우스 헤드 및 dedecalcified 뼈 조직의 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제공하고, 세포 증식, 세포 사멸 및 BMP 신호 마커의 면역 염색을 위한 냉동 부피. 우리는 또한 면역 형광 이미지에서 정량적 데이터를 얻기위한 전략을 자세히 설명합니다. 그 방법은 또한 적절한 수정을 가진 그밖 조직에 적용될 수 있습니다.

조직 준비를위한 조건은 조직의 크기와 유형에 따라 다릅니다. 고정 및 냉동 보호 시간은 일반적으로 하룻밤에 몇 시간이 필요합니다. 고정 후, 조직은 파라핀에 내장되어 마이크로토메16으로단면화 될 수 있습니다. 파라핀과 OCT 는 면역 염색에 잘 작동하지만, 그들 사이에는 몇 가지 차이점이 있습니다. 파라핀 블록은 RT에서 수년 동안 보관할 수 있으며 OCT 블록은 -80 °C에서 1 년 동안 유지됩니다. 파라핀은 조직 형태를 보존하며, OCT 포함 중에 형성된 얼음 결정은 조직 구조에 부정적인 영향을 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 국립 보건원 (R01DE020843 ~ Y.M.), 국제 FOP 협회 (Y.M.), 중국 국립 자연 과학 재단 (31500788 ~ J.Y.)의 보조금 지원으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
접착 테이프Leica#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibodyInvitrogenA-11034
Antifade Mountant with DAPIInvitrogenP36931
Bovine serum albuminSigmaA2153
CoverslipsFisher Brand12-545-E
CryostatLeicaCM1850
EDTASigmaE6758
형광 현미경OlympusBX51
GelatinSigmaG1890
nbsp; 세포 사멸 감지 키트MilliporeS7165
현미경 슬라이드Fisher 브랜드12-550-15
OCT 화합물Fisher Healthcare23-730-571
파라포름알데히드 (PFA)SigmaP6148 
인산염 완충 식염수 (PBS)SigmaP4417
폴리에틸렌 글리콜  tert-옥틸페닐 에테르SigmaT9284Triton X-100
Proteinase KInvitrogenAM2542
Rabbit anti-Ki67 항체세포 신호 기술9129Lot#:3; RRID:AB_2687446
토끼 anti-pSmad1/5/9 항체세포 신호 기술13820Lot#:3; RRID : AB_2493181
구연산 나트륨시그마1613859
자당시그마S9378
트리스시그마10708976001
현장 현미경&

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al.

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Tissue PreparationImmunostainingMouse CraniofacialUndecalcified BoneCryosectioningImmunofluorescenceProtein DetectionGelatin EmbeddingAntibody StainingFluorescence Quantification

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