ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염

Summary

여기, 우리는 transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq) 활성화 된 CD4 + 인간 림프 톨에 시퀀싱에 대 한 분석 결과 수행 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 새로운 세포의 용 해 버퍼의 도입을 통해 3%로 50%에서 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 최소화 하기 위해 수정 되었습니다.

Abstract

ATAC seq 신속 하 고 간단한 접근 방식 게놈 넓은 접근 chromatin 매핑 때문에 epigenetics의 연구에 널리 사용 되는 방법론 되고있다. 이 문서에서 우리는 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 감소 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 제시. 이 프로토콜에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 감소 3%의 평균에 미토 콘 드리 아 DNA 오염 이전 ATAC seq 프로토콜 분투 하는 동안 50% 오염 미토 콘 드리 아 DNA의 평균이 읽습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용에 가까운 50% 감소를 허용 한다. 시연 어떻게이 높은-품질 ATAC seq 라이브러리 활성화 된 CD4 + 세포에서 준비 될 수 있다 데이터 분석을 통해 전체 혈액에서 CD4 + 림프 구 분리에서 단계별 지침을 제공 합니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 다양 한 셀 형식에에서 검증은 고 chromatin 접근성을 공부 하는 연구원에 즉시 사용 될 것입니다.

Introduction

Transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq)을 시퀀싱에 대 한 분석 결과 빠르게 chromatin 구조 질의 대 한 주요 방법 되고있다. ATAC seq tagmentation, 분할 및 라이브러리는 시퀀싱 전체 게놈에서 chromatin 내게 필요한 옵션 확인 수를 생산 하는 동일한 효소에 의해 DNA의 태그의 과정을 통해 액세스할 수 있는 chromatin의 영역을 식별할 수 있습니다. 이 tagmentation 과정만 인하 nucleosomic 입체 지 장 때문 chromatin의 오픈 지역 활동적인 Tn5 transposase에 의해 중재 됩니다. 그것은 삭감으로 Tn5 transposase를 PCR에 의해 빠른 라이브러리 건설과 게놈 넓은 접근 chromatin^1,2의 다음-세대 시퀀싱 시퀀싱 어댑터를 삽입 합니다.

ATAC seq 비교적 간단 하 고 빠른 프로토콜, 품질 및 그 결과, 그리고 시작 물자 필요의 작은 금액에서 결정 될 수 있는 정보의 범위 chromatin 접근성의 영역을 결정 하기 위해 선호 되는 방법 되고있다. 비해 DNase seq³ (는 ....

Protocol

이 향상 된 프로토콜 데이터 분석 (그림 1)을 통해 전체 혈액의 시작 물자에서 CD4 + 세포의 ATAC seq를 수행 하기 위한 단계별 지침을 제공 합니다.

1. 전체 혈액에서 CD4 + T 세포의 고립

참고: 이 프로토콜에 대 한 시작 물자는 선정 될 시작 물자의 소스 연구 요구 사항에 따라 수 있도록 표준 절차를 사용 하 여 수집 하는 신선한 전 혈의 15 mL 이다. 필요에 따라 프로토콜을 확장 합니다. 미리 따뜻한 인산 염 (PBS) + 2% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 실내 온도 (RT)를 버퍼링 하 고 CD4 + T 세포 농축 절차를 시작 하기 전에 rt 원심 분리기를 조정 합니다.

1. 15 ml 50 mL 원뿔 튜브에 전체 혈액의 인간의 CD4 + T 세포 농축 칵테일의 750 µ L을 추가 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합. 20 분에 대 한 RT에서 품 어. 부 화 완료 되 면 튜브에 15 mL PBS + 2 %FCS 추가 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합.
2. 15 mL 밀도 매체의 신선한 50 mL 원뿔 튜브를 준비 합니다. 조심 스럽게 희석된 혈액 샘플 ....

Results

신선한 전 혈의 15 mL에서이 프로토콜 1 백만 CD4 + T 세포의 평균을 생성합니다. 이들은 나중에 처리에 대 한 동결 하거나 즉시 사용 될 수 있습니다. 신선한 또는 해 동, CD4 + T 세포의 생존 능력은 일관 되 게 > 95%. CD4 + T 세포 고립의이 메서드는 소스 재료와 컬렉션 시간에 유연성에 대 한 수 있습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 µ 1 ng/L 보다 큰 마지막 라이브러리를 생성합니다. 상업적으로 사용할 수 있는 시스템을 사용 하 여 수행 하는 품질 관리 200 및 1000 bp (그림 2) 사이의 DNA 파편을 입증 해야 합니다. 시퀀싱은 고품질 라이브러리만 수행 되어야 한다.

모든 라이브러리 샘플 당 읽기 40 백만 이상의 평균 깊이에 시퀀싱 했다. AT.......

Discussion

이 문서에 제공 된 수정된 ATAC seq 프로토콜 최소한의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 재현 가능한 결과를 제공 합니다. 프로토콜이 되었습니다 사용 성공적으로 인간의 기본 PBMCs¹⁰, 인간 monocytes, (미 출판), 마우스 수지상 세포의 염색 질 건축 특징 및 교양된 흑색 종 세포 라인¹¹. 우리는이 향상 된 세포 예상 상태 뿐만 아니라 다른 세포 유형 대 일 가능성이 있다. 그것 또한이 핵 격리 프로토콜 단일 핵 ATAC seq 프로토콜, 시퀀싱 결과 개선 하는 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화와 호환 된다는 것을 예상 된다.

이 수정된 프로토콜의 추가 혜택을 환자 샘플의 여부에 따라 서로 다른 시간에 PBMCs에서 고립 된 CD4 + T 세포의 배치를 동결 능력입니다. ATAC seq 다음 모든 샘플에서 동시에 수행할 수 있습니다, transposase 반응 및 시퀀싱에 잠.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS 1개, 멸균	Gibco	10010023	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
5810/5810  R Swing Bucket 50 mL, 15 mL 및 1.5 mL 튜브 버킷이 포함된 냉장 원심분리기	Eppendorf	22625501	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
96웰 라운드 바닥판	Thermo Scientific	163320	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
Agilent 4200 테이프 스테이션 시스템	품질 평가를 위해	Agilent	G2991AA
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
DMSO	시그마	D8418	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	중요 구성 요소
Dynabeads 손대지 않은 Human CD4 T 세포 키트	Invitrogen Life Technologies	11346D	중요 구성 요소
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	중요 구성 요소
FCS	Gemini Bio Products	100-500	다른 유사한 것을 사용할 수 있습니다. 제품.
고감도 DNA 키트	애질런트	50674626	품질 평가를 위해 제안됩니다.
염화마그네슘, 육수화물, 분자 생물학 등급	시그마	M2393	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
MinElute PCR 정제 키트(버퍼 PB, 버퍼 PE, 용리 버퍼)	Qiagen	28004	중요 구성 요소
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
NaCl, 분자 생물학 학년	시그마	S3014	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
폴리 소르 베이트 20 (Tween20)	시그마	P9416	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
PowerUp SYBR 그린 마스터 믹스	Applied Biosystems	A25780	중요 성분
정밀 수조	Thermo Scientific	TSGP02	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
QIAquick PCR 정제 키트: Qiagen		28104	중요 구성 요소
, Qubit dsDNA HS 분석 키트	, Invitrogen Life Technologies	Q32851	품질 평가용으로 제안됨.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	품질 평가에 제안됨.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail Stem	Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
멸균 Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.
Tris-HCL	Sigma	T5941	다른 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.