글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정
Summary
여기, 프로토콜 캡슐화 및 poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels fluorogenic 매트릭스 metalloproteinase (MMP)와 기능성된에 세포 배양에 대 한 제시는-분해 펩 티 드. 세포질 MMP와 대사 활동 표준 microplate 리더를 사용 하 여 하이드로 겔 문화에서 직접 측정 됩니다.
Abstract
3 차원 (3D) 세포 배양 시스템 종종 더 자세히 정리 vivo에서 세포 반응과 기능 전통적인 2 차원 (2D) 문화 시스템 보다. 그러나, 세포 기능 3D 문화에서의 측정은 종종 더 많은 도전. 많은 생물학 분석 실험 3D 문화에 어려울 수 있는 셀룰러 자료의 검색을 해야 합니다. 이 문제를 해결 하기 위해 한 가지 방법은 셀 함수는 재료 내에서 측정을 가능 하 게 새로운 자료를 개발 하는 것입니다. 여기, 96 잘 형태로 3D hydrogels에서 셀룰러 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 활동의 측정에 대 한 메서드가 제공 됩니다. 이 시스템에서는, poly(ethylene glycol) (PEG) 하이드로 겔은 기능성 fluorogenic MMP 쪼갤 센서. 세포질 MMP 활동 형광 강도에 비례 하 고 표준 microplate 리더와 측정 될 수 있다. 소형화 96 잘 형식이 분석 결과의 분석 결과의 이전 24 잘 버전에 비해 조건 당 80 %50 %와 시 약 사용에 의해 실험 설정에 필요한 시간을 감소. 이 분석 결과 또한 세포질 기능의 다른 측정에 호환 됩니다. 예를 들어 대사 활동 분석 결과 시연입니다 여기, MMP 활동 측정 같은 히드로 내 동시에 실시 될 수 있습니다. 분석 결과 시드 밀도 분석 결과의 작업 범위에 대 한 적절 한 캡슐화 밀도 결정 하는 셀의 범위에 걸쳐 캡슐화 인간 흑색 종 세포와 함께 설명 했다. 셀 캡슐화의 24 h 후 MMP와 대사 활동 표시기 셀 시드 밀도에 비례 했다. 분석 결과 한 fluorogenic 분해성 기판으로 여기 설명 된다, 하는 동안 분석 결과 및 방법론 수 있습니다 다양 한 하이드로 겔 시스템 및 다른 형광 센서에 대 한 적응. 이러한 분석 결과 다양 한 응용 프로그램에 대 한 실용적인, 효율적이 고 쉽게 접근할 수 있는 3D 자란 플랫폼을 제공.
Introduction
3 차원 (3D) 문화 시스템 종종 더 밀접 하 게 전통적인 2 차원 (2D) 문화 시스템 보다 vivo에서 세포 응답을 정리, 여러 우수한 간행물1,2,3 참조 . 그러나, 세포 기능을 측정 하기 위해 3D 문화 시스템을 활용 하 여 셀룰러 검색의 어려움 때문에 도전 되 고 추가 처리. 이 어려움 3 차원 배양 시스템에서 많은 세포 기능 측정을 제한합니다. 이 어려움을 극복 하기 위해 새로운 기술을 쉽게 측정 3D 환경에서 셀 함수를 사용할 수 있는 필요. 이 필요 해결 하기 위해 한 가지 방법은 세포 기능을 측정 하는 센서 뿐 아니라 3D 세포 배양을 지원 뿐만 아니라 재료의 개발 이다. 예를 들어 여러 하이드로 겔 시스템 fluorogenic 효소 쪼갤 moieties 3D 환경4,5,,67프로 테아 제 활동의 시각화 수 있도록 통합 했습니다. 이러한 시스템은 원래 현미경 이미징에 대 한 활용 하 고, 하는 동안 이러한 시스템도 3D에 셀 함수의 손쉬운 측정을 사용 하면 표준 플레이트 리더를 사용 하 여 글로벌 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 활동 분석에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 환경8.
MMPs, 아연 프로 테아 제, superfamily 정상 조직의 항상성 그리고 많은 질병에 중요 한 역할을 재생합니다. MMPs 저하와 세포 외 기질 (ECM) 개장, 세포 표면 수용 체, cytokines를 쪼개 고 다른 MMPs9,10활성화. MMPs 상처 치유 등 생리 적 과정에 고 등 관절염, 동맥 경화, Alzheimer, 암 ( 9,,1011리뷰 참조) 질병에 중요 한 역할을 재생 합니다. 암, MMP 식 상부는 암 전이 및 빈약한 예 지12와 강하게 상관 된다. 또한, MMPs 암 세포 내 습 및 마이그레이션, 본질적으로 3D 현상13,14는 세포질 과정을 홍보 하 여 종양 진행에 기여 한다. 따라서, 근본적인 생물학 연구 및 약물 분석 검사를 포함 하 여 많은 문맥에서 3 차원 문화에 MMP 활동을 측정 하는 능력에 많은 관심이 있다.
그들의 높은 함량으로 인해 3D 세포 배양, 단백질 흡착, 및 가변 자연 저항을 못 hydrogels 널리 사용 됩니다. 못 hydrogels 있다 되어 기능성 moieties 직접 세포 기능에의 번호와 같이 RGD, 같은 RLD, IKVAV 세포 접착을 촉진 또는 변형 성장 인자-β (TGF-β) 등 성장 요인의 tethering 직접 ECM 모방 펩 티 드와 15,16. 더 최근에, 말뚝 hydrogels 있다 되어 기능성 잘5,8로 세포 기능 측정을 사용할 수 있는 센서 펩 티 드와 함께. 특히, PEG 하이드로 겔 시스템의 사용 fluorogenic 표준 플레이트 리더와 3D 문화에서 셀룰러 MMP 활동의 MMP 분해 펩 티 드 활성화 측정으로 기능성 고 아니 추가 처리 하는 데 필요한. 이러한 시스템은 또한 신진 대사 활동을 포함 하 여 세포질 기능의 다른 측정에 호환 됩니다. 여기, 프로토콜은 3D 못 하이드로 겔 fluorogenic MMP 분해 펩타이드와 기능성된 및이의 사용에 필요한 초기 최적화 실험을 보여주는 제시 결과에서 경작 하는 세포의 MMP 활동의 측정에 대 한 설명 분석 결과입니다. 인간 흑색 종 세포 (A375) 시드 범위 내에 있는 작업 분석 결과의 적절 한 시드 밀도 결정 하는 밀도의 범위 fluorogenic hydrogels에 캡슐화 되었습니다. 캡슐화의 24 h 후 MMP와 대사 활동 측정 했다 표준 microplate 리더를 활용 하 여. 다음, MMP 활동 분석 결과의 선형 범위 내에서 시드 밀도 결정 하는 신진 대사 활동을 정상화 했다. 마지막으로, 내부 플레이트 계수의 편차 백분율 (%CV) 얻은 결과의 재현성을 반영 하기 위해 triplicates 사이 계산 했다. 이 메서드는 간단 하 고 빠른 3D 세포 배양, 그리고 최소한의 샘플 처리와 프로 테아 제 활동의 쉽게 측정을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
3 차원 생체 외에서 세포 배양이 vivo에서 환경의 많은 중요 한 측면. 그러나, 3D 문화 또한 사정 세포 기능을 만들고 도전 신호, 많은 생물학 분석 실험 필요 셀룰러 검색 및 셀의 큰 숫자. 따라서, 개발 추가 샘플 없이 세포질 기능의 측정을 가능 하 게 간단한 3D 문화 시스템의 처리 크게 증가 시킬 것입니다 3D 문화 시스템의 유틸리티. 여기서 설명 하는 3D 시스템은 다양 한 다른 응용 프로그램에 대 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 오하이오 암 연구 (OCR), 오,이 작품을 자금에 대 한 미국 킹 사우드 대학 (KSU), 리야드, 첫 번째 작가 후원을 위한 KSA 인정 하 고 싶습니다. 매트릭스 지원, 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI) 캠퍼스 화학 악기 센터 질량 분석 및 단백질의 도움으로 질량 분석을 사용 하 여 형광 펩 티 드 센서의 분자량 측정 오하이오 주립 대학에서 시설입니다.
Materials
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
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