절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

Summary

여기, 선물이 자기 세포 분류와 순진한 쥐로 후속 입양 전송 murine spleens에서 수지상 세포를 분리 하는 프로토콜. 높은 소금 활성화 수지상 세포의 모델 입양 전송 및 cytometry의 단계별 절차를 설명 하기 위해 선택 되었다.

Abstract

초과 규정식 소금 입구 염증에 기여 하 고 고혈압의 개발에 중요 한 역할을 한다. 우리는 이전 수지상 세포 항 원 선물 (DCs) 높은 extracellular 나트륨 NADPH 산화 효소의 활성화 및 isolevuglandin (IsoLG)의 형성을 느낄 수 있다 발견-단백질 adducts. 이러한 IsoLG 단백질 adducts 자기 단백질 반응 고 상태 처럼 자가 면역 질환 및 고혈압. 우리가 개발 하 고 고혈압에 DC 기능 연구-의 상태--예술 방법 최적화. 여기, 상세한 프로토콜을 제공 격리에서 높은 나트륨와 murine 비장 CD11c 입양 이전 체 외 치료 고혈압에 그들의 역할을 공부 하는 받는 사람 쥐로⁺ 세포.

Introduction

식이 과잉 소금은 고혈압에 대 한 주요 위험 요소. ^{1 , 그러나 2} 미국 심장 협회 권장 최대 2300 밀리 그램 (mg)의 하루 나트륨 (Na⁺) 섭취; 미국 인구의 10% 미만 관찰이 추천. ^{3 , 4} 나⁺ 입구에 있는 겸손 한 감소 혈압을 낮출 하 고 20%로 관상 동맥 심장 질환과 뇌졸중은 미국에서의 매년 새로운 사례를 감소. ⁵ 과잉 소금 소비와 주요 문제는 고혈압 인구의 50% 소금 감도, 전시 나⁺ 로드 또는 혈압에 비슷한 드롭 없음^{후 다음 혈압에서 10 mmHg 증가 정의 +} 제한 및 diuresis. ⁶ 소금 감도 또한 normotensive 개인의 25%에서 발생 하 고 심장 혈관 사건 및 죽음의 독립적인 예측 이다. ^{7 , 8} 소금 감지 메커니즘 신장과 관련 된 고혈압에 잘 공부 되었다; 그러나, ....

Protocol

밴 더 빌 트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인 했습니다. 마우스는 보관 및 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박 가이드에 대 한 걱정. 수정된 2010)입니다.

1입니다. 마우스에서 Spleens의 격리

1. 1640 RPMI 준비: 10 %FBS, 0.10 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 50 µ M β-mercaptoethanol와 1% 페니실린/스.
2. 10-12 주를 안락사-오래 된 공동₂ 흡입에 의해 남성 마우스 C57bl/6. 가슴 및 마우스의 70% 에탄올 스프레이. 왼쪽된 측면에서 조심 스럽게 열고 피부 노출 비장 복 막 구멍.
3. 신중 하 게 마우스의 왼쪽에 창 고 간 이동 작은 집게를 사용 하 고 부드럽게 잘가 위를 사용 하 여 삭제할 비장.
   참고: 이 단계를 수행 해야 합니다 매우 신중 하 게 위장 손상 오염을 일으킬 수 있다.
4. 장소 각 레이블이 15 mL 원뿔 튜브 포함 된 RPMI 1640 매체의 3 mL에에서 비장 excised.

2. 세대 Spleens에서 단일 셀 정지의

Results

그림 1 설명 단계 위의 회로도를 나타냅니다. 절연된 murine spleens CD11c 정렬 됩니다⁺ 마그네틱 셀 정렬 및 48 h. CD11c 일반 소금 미디어 (NS; 150 mmol NaCl) 또는 높은 소금 미디어 (HS; 190 mmol NaCl) 도금에 의해 Dc⁺ Dc 복고풍 궤도 adoptively 전송한 다음 순진한 받는 사람 쥐 하는 주입 10 일 후, 마우스는 14 일에 대 한 낮은 복용량 angiotensin II (140 ng/kg/min) 주입을 위한 삼 투 minipumps로 이식. Angiotensin II의 14 일간 주입, 동안 혈압 라디오 원격 또는 꼬리 팔목 plethysmography 기록 됩니다.

일반적인 혈압 분석 표시 됩니다 .......

Discussion

현재 프로토콜에서 우리 CD11c 분리 하는 절차를 최적화⁺ Dc spleens 마우스 및 adoptively에서 순진한 동물 소금 유발 고혈압에 Dc의 역할을 연구 하기에 그들을 전송. 이 프로토콜은 격리 하 고 adoptively 대 식 세포, T와 B 림프 톨을 포함 하 여 적응 면역 세포, monocytes, 등 다른 면역 세포 하위 집합을 전송 적용할 수 있습니다. 우리는 적절 한 세포 생존 및 DC 표면 식 마커의 안정성 비장 소화 프로세스를 최적화 했습니다. 또한, 우리는 최적의 DC 생존에 대 한 높은 나트륨 murine Dc의 생체 외에서 자극에 대 한 프로토콜을 최적화 했습니다.

이 프로토콜에서 중요 한 단계는 자기 세포 분류. 자기 세포 분류 질병에 면역 세포의 기능을 공부에 대 한 특정 murine 종류를 분리 하는 강력 하 고 편리한 도구입니다. 그러나, 그것 기반으로 기본 셀 표면 식 마커 CD11c를 포함 하 여 하나 이상의 면역 세.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC/Cy7 안티-마우스 CD11c	Biolegend	117324
autoMACS 러닝 버퍼	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads 초순수	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS 칼슘과 마그네슘 없음	Corning	21-031-CV
FcR 차단 시약	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC 안티 마우스 CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C 튜브	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS 해리기 장치	Miltenyi Biotec	130-093-235	사용 프로토콜 : Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable 바이올렛 사각 세포 염색 키트	Invitrogen	L34964
LS 컬럼	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs 분리기	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 중간	깁코	11835-030