Flow Cytometric analyse af ekstracellulære vesikler fra celle-aircondition medier
Summary
Protokollen beskriver en reproducerbar metode udviklet til brug med celle kultur analysere at opdage overflade epitoper på små ekstracellulære vesikler (EV). Det udnytter specifikke EV immunoprecipitation ved hjælp af perler kombineret med antistoffer, der genkender overflade antigen CD9, CD63 og CD81. Metoden er optimeret til downstream flow flowcytometri analyse.
Abstract
Flowcytometri (FC) er den foretrukne metode til semi-kvantitative målinger af celle-overflade antigen markører. For nylig, denne teknik er blevet brugt for fænotypiske analyser af ekstracellulære vesikler (EV) herunder exosomes (Exo) i det perifere blod og andre kropsvæsker. Den lille størrelse af EV mandater brugen af dedikerede instrumenter at have en påvisningsgrænse omkring 50-100 nm. Alternativt, EV kan være bundet til latex microbeads, der kan registreres af FC. Microbeads, konjugeret med antistoffer, der genkender EV-associerede markører/klynge af differentiering CD63, CD9 og CD81 kan bruges til EV capture. EXO isoleret fra CM kan analyseres med eller uden forudgående berigelse af ultracentrifugering. Denne fremgangsmåde er egnet til EV analyser ved hjælp af konventionelle FC instrumenter. Vores resultater viser en lineær korrelation mellem betyde fluorescens intensitet (MFI) værdier og EV koncentration. Forstyrre EV gennem sonikering dramatisk faldt MFI, der angiver, at metoden ikke registrerer membran rester. Vi rapporterer en nøjagtig og pålidelig metode til analyse af EV overflade antigener, som nemt kan implementeres i alle laboratorier.
Introduction
Celler udskiller ekstracellulære vesikler (EV) i forskellige størrelser, herunder microvesicles (MV) og exosomes (Exo). Sidstnævnte kan skelnes fra MV ved både størrelse og subcellulært rummet af oprindelse. MV (200-1000 nm i størrelse) frigives fra overordnede celler ved at udgyde fra plasmamembran. Omvendt Exo (30-150 nm) stammer fra endosomal membraner og er udgivet i det ekstracellulære rum, når de multivesicular organer (MVB) fuse med cellemembranen1,2.
EV i stigende grad bruges som diagnostisk biomarkører så godt som, potentielt, terapeutiske værktøjer på mange områder herunder onkologi, neurologi, kardiologi og bevægeapparatet sygdomme3,4,5. Et stort flertal af igangværende undersøgelser ved hjælp af EV som terapeutiske agenter udnytter isolation af vesikler fra celle-aircondition medium (CM) af in vitro-kulturperler celler. Mesenchymale stamceller (msc) udøve gavnlige virkninger i flere sammenhænge, og MSC-afledte EV har vist fordele i modeller af Myokardie iskæmi/reperfusion skade6 og hjerne skade7. MSC-afledte EV også udviser immun modulerende aktiviteter, der kan udnyttes til at behandle immun afvisning, som påvist i en model af terapi-ildfaste graft – versus – host-sygdommen8. Fostervand væske stamceller (hAFS) aktivt berige CM MVs og Exo, uensartet fordelt i størrelse (50-1000 nm), der mægle flere biologiske effekter, såsom spredning af differentierede celler, angiogenese, hæmning af fibrose, og cardioprotection4. Vi har for nylig vist, at EV, og især Exo, udskilles af menneskelige hjerte-afledte stamceller (Exo-CPC) reducere Myokardie infarkt størrelse i rotter5,9.
EXO deler et fælles sæt af proteiner på deres overflade, herunder tetraspanins (CD63, CD81, CD9) og store histocompatibility komplekse klasse I (MHC-jeg). Ud over denne fælles proteiner, Exo også indeholder proteiner specifikke for EV delmængde af typen producent celle. EXO markører få afgørende betydning, fordi de spiller en afgørende rolle i Inter cellulære kommunikation, derved regulere mange biologiske processer5,10. På grund af deres lille størrelse, at finde en nem måde at analysere EV ved hjælp af klassisk flow flowcytometri (FC) forbliver en udfordrende opgave.
Vi præsenterer her, en forenklet protokol for EV analyse ved hjælp af FC, som kan anvendes til pre beriget prøver gennem ultracentrifugering eller direkte til CM (figur 1). Metoden bruger perler belagt med en bestemt antistof, der bindes kanoniske Exo-associerede overflade epitoper (CD63, CD9, CD81) uden yderligere vasker. FC analyser kan udføres ved hjælp af en konventionel Flowcytometret uden behov for justeringer før målinger. Metoder til karakterisering af antigener på enkelte små partikler ved hjælp af flow cytometers har været beskrevet af andre grupper med hensyn til forskellige applikationer11,12,13. Her, brugte vi functionalized magnetiske perler til fangst af små partikler og Exo, efterfulgt af fænotyper fanget partikler af FC. Selv om denne metode kan bruges til at karakterisere antigene sammensætning af små blærer udgivet af enhver in vitro-celletype, givet her vi specifikke celle kultur betingelser, der gælder for kulturen i menneskers hjerte stamceller (CPC) og mest passende miljø til produktion af EV af disse celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konventionelle FC teknik er fortsat den mest enkle analytisk metode til at karakterisere markører udtrykkes på overfladen af EV. I denne henseende, er at vælge den mest hensigtsmæssige protokol afgørende for at få nyttige oplysninger om individuelle partikel fraktioner af interesse ved at undgå begrænsninger på grund af instrument følsomhed. Vi beskrevet en metode, ved hjælp af magnetiske partikler kombineret med antistoffer, der genkender Exo og små EV overflade antigener, som er egnet til downstream FC ans?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.B. blev støttet af forskningsbevillinger Helmut Horten Stiftung og Velux Stiftung, Zürich (Schweiz). G.V. blev støttet af forskningsbevillinger for Swiss National Science Foundation, Cecilia-Augusta Foundation, Lugano og SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Schweiz)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
