Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen
Summary
Het protocol wordt een reproduceerbare methode ontworpen voor gebruik met cel cultuur supernatant voor het opsporen van oppervlakte epitopes op kleine extracellulaire blaasjes (EV) beschreven. Het maakt gebruik van specifieke EV immunoprecipitation met parels in combinatie met de antilichamen die surface antigeen CD9 herkent, CD63, en CD81. De methode is geoptimaliseerd voor downstream stroom cytometry analyse.
Abstract
Stroom cytometry (FC) is de methode van keuze voor semi-kwantitatieve meting van celoppervlak antigeen markers. Onlangs, is deze techniek gebruikt voor analyses van de fenotypische van extracellulaire blaasjes (EV) met inbegrip van exosomes (Exo) in het perifere bloed en andere lichaamsvloeistoffen. De kleine grootte van EV mandaten het gebruik van speciale instrumenten met een detectie-drempel rond 50-100 nm. EV kan als alternatief worden gebonden aan latex microbeads die kunnen worden gedetecteerd door FC. Microbeads, geconjugeerd met antilichamen die EV-geassocieerde markeringen/Cluster van differentiatie CD63, CD9 en CD81 herkent kunnen worden gebruikt voor het vastleggen van de EV. Exo geïsoleerd van CM kan met of zonder pre verrijking door ultracentrifugatie worden geanalyseerd. Deze aanpak is geschikt voor EV analyses met behulp van conventionele FC instrumenten. Onze resultaten tonen aan dat een lineaire correlatie tussen bedoel fluorescentie intensiteit (MFI) waarden en EV concentratie. EV verstoren door ultrasoonapparaat dramatisch gedaald MFI, die aangeeft dat de methode geen membraan puin detecteert. Wij rapporteren een nauwkeurige en betrouwbare methode voor de analyse van EV oppervlakte antigenen, die eenvoudig kan worden geïmplementeerd in een laboratorium.
Introduction
Cellen afscheiden extracellulaire blaasjes (EV) van verschillende grootte, met inbegrip van microvesicles (MV) en exosomes (Exo). De laatste kan worden onderscheiden van MV door zowel de grootte als de subcellular compartiment van herkomst. MV (200-1000 nm in grootte) worden vrijgegeven uit bovenliggende cellen door het vergieten van het plasma-membraan. Omgekeerd, Exo (30 – 150 nm) zijn afkomstig uit de endosomal membranen en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte wanneer de multivesicular instanties (MVB) zekering met de celmembraan1,2.
EV worden steeds meer gebruikt als diagnostische biomarkers zo goed als, potentieel, therapeutische instrumenten op veel gebieden zoals oncologie, neurologie, cardiologie en musculoskeletale aandoeningen3,4,5. Een overgrote meerderheid van lopende studies met behulp van de EV als therapeutische middelen het isolement van de blaasjes van cel-geconditioneerd medium (CM) van de in vitro gekweekte cellen benutten. Mesenchymale stamcellen (MSCs) uitoefenen gunstige effecten in verschillende contexten, en MSC-afgeleide EV voordelen in modellen van myocardiale ischemie/reperfusie letsel6 en hersenen verwonding7hebben aangetoond. MSC-afgeleide EV vertonen ook immuun f activiteiten die kunnen worden benut om de behandeling van de verwerping van het immuunsysteem, zoals aangetoond in een model van therapie-vuurvaste graft – versus – host-ziekte8. Vruchtwater vloeistof stamcellen (hAFS) actief verrijken CM met MVs en Exo, ongelijkmatig verdeeld in grootte (50 – 1.000 nm), die verschillende biologische effecten, zoals verspreiding van gedifferentieerde cellen, angiogenese, remming van de fibrose, bemiddelen en cardioprotection4. Wij hebben onlangs aangetoond dat EV, en met name Exo, uitgescheiden door menselijke cardiale afkomstige voorlopercellen (Exo-CPC) verkleinen myocardiale infarct in ratten5,9.
Exo delen een gemeenschappelijke set van eiwitten op hun oppervlak, met inbegrip van tetraspanins (CD63, CD81, CD9) en grote histocompatibility complex klasse I (MHC-ik). Naast deze gemeenschappelijke set van eiwitten, Exo bevatten ook eiwitten specifiek voor de EV subset van het celtype producent. Exo-markeringen zijn vaandel wint, omdat ze een cruciale rol in de Inter cellulaire communicatie spelen, waardoor vele biologische processen5,10te reguleren. Vanwege het kleine formaat, het vinden van een gemakkelijke manier om het analyseren van de EV met behulp van klassieke stroom cytometry (FC) blijft een uitdagende taak.
Hier presenteren we een vereenvoudigde protocol voor EV-analyse met behulp van FC, die kan worden toegepast op verkregen via ultracentrifugatie vooraf verrijkte monsters of rechtstreeks naar CM (Figuur 1). Zonder extra wasbeurten gebruikt de methode kralen bedekt met een specifiek antilichaam dat canonieke Exo-geassocieerde oppervlakte epitopes (CD63, CD9, CD81 bindt). FC analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van een conventionele cytometer met geen noodzaak van aanpassingen voorafgaand aan metingen. Methoden voor de karakterisatie van antigenen op individuele kleine deeltjes met behulp van flow cytometers zijn beschreven door andere fracties met betrekking tot diverse toepassingen11,–12,13. Hier, we matiemaatschappij magnetische kralen gebruikt voor het vangen van kleine deeltjes en Exo, gevolgd door fenotypering van gevangen deeltjes door FC. Hoewel deze methode kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de antigene samenstelling van kleine blaasjes uitgebracht door elk celtype in vitro, mits hier we specifieke cel cultuur voorwaarden die van toepassing zijn voor de cultuur van menselijke cardiale voorlopercellen (CPC) en de meeste passende omgeving voor de productie van de EV door deze cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Conventionele FC techniek blijft de meest eenvoudige analytische methode te karakteriseren markeringen uitgedrukt op het oppervlak van EV. In dit verband is het meest geschikte protocol selecteren cruciaal voor het verkrijgen van nuttige informatie over individuele deeltjes breuken van belang door het vermijden van beperkingen als gevolg van gevoeligheid van het instrument. We beschreven een methode met behulp van magnetische deeltjes in combinatie met de antilichamen die Exo en kleine EV oppervlakte antigenen die geschi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.B. werd gesteund door onderzoekssubsidies van Helmut Horten Stiftung en Velux Stiftung, Zurich (Zwitserland). G.V. werd gesteund door onderzoekssubsidies van Zwitserse National Science Foundation, de Cecilia-Augusta-Stichting, Lugano en de SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Zwitserland)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
