Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока
Summary
Протокол описывает используется воспроизводимый метод, предназначенный для использования с supernatants культуры клеток для обнаружения поверхностных epitopes на небольших внеклеточного везикулы (EV). Он использует конкретные иммунопреципитации EV, с использованием бисера в сочетании с антителами, которые признают поверхностный антиген CD9, CD63 и CD81. Этот метод оптимизирован для анализа цитометрии вниз по течению потока.
Abstract
Проточной цитометрии (FC) является методом выбора для полуколичественного определения клетк поверхности антиген маркеров. Недавно этот метод был использован для фенотипического анализа внеклеточного везикулы (EV) включая exosomes (Exo) в периферической крови и других жидкостях организма. Небольшой размер EV мандатов использование специальных инструментов порог обнаружения вокруг 50-100 Нм. Кроме того EV могут быть привязаны к латекса микрошарики, которая может быть обнаружена ФК. Микрошарики, конъюгированных с антителами, которые признают EV-связанные маркеры/Кластер дифференцировки CD63, CD9 и CD81 могут быть использованы для захвата EV. EXO изолированы от см могут быть проанализированы с или без предварительного обогащения ultracentrifugation. Этот подход подходит для анализа EV, с использованием обычных инструментов ФК. Наши результаты показывают линейной корреляции между значениями означают интенсивности флуоресценции (MFI) и концентрации EV. Нарушая EV через sonication резко сократилась МФО, указывающее, что метод не может обнаружить мембраны мусора. Мы приводим точный и надежный метод для анализа поверхностных антигенов EV, которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории.
Introduction
Клетки секретируют внеклеточного везикулы (EV) разных размеров, включая микровезикулы (MV) и exosomes (Exo). Последний можно отличить от MV, размер и внутриклеточных отсек происхождения. MV (200 – 1000 Нм в размер), освобождаются от родительской клетки пролить от плазматической мембраны. И наоборот экзо (30 – 150 Нм) происходят из мембран от англ и выпускаются во внеклеточное пространство, когда multivesicular органов (MVB) предохранитель с клеточной мембраны1,2.
EV все чаще используется как диагностические биомаркеров а также, потенциально, терапевтические средства во многих областях, включая онкология, Неврология, кардиология и опорно-двигательного аппарата3,4,5. Подавляющее большинство текущих исследований с использованием EV как терапевтические эксплуатировать изоляции везикулы от клеток кондиционером среднего (см) в пробирке культивируемых клеток. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) оказывают благотворное влияние в нескольких контекстах, и MSC-производные EV показали преимущества в моделях миокарда ишемии/реперфузии травмы6 и мозга травмы7. MSC-производные EV также демонстрируют иммунной модулирующее мероприятий, которые могут быть использованы для лечения иммунной отказа, как показано в модель терапии огнеупорные трансплантат – versus – хост болезни8. Амниотической жидкости стволовых клеток (Хафс) активно обогатить см с MVs и Exo, гетерогенно распределены в размер (50-1000 Нм), который посредником несколько биологических эффектов, таких как распространение дифференцированных клеток, ангиогенез, ингибирование фиброз, и кардиопротекции4. Недавно мы показали, что EV и особенно Exo, выделяется клетками человеческого сердца производные Прародителя (Exo-КПК) уменьшить размер при инфаркте миокарда в крысах5,9.
EXO доля общий набор белков на их поверхности, в том числе tetraspanins (CD63, CD81, CD9) и комплекс гистосовместимости I класса (MHC-I). Помимо этого общий набор белков экзо также содержат белки, специфичных для EV подмножество типа клеток продюсер. EXO маркеры приобретают первостепенное значение, потому что они играют решающую роль в между сотовой связи, регулирования таким образом многие биологические процессы5,10. Из-за их малого размера найти простой способ для анализа EV, с использованием классического потока цитометрии (FC) остается сложной задачей.
Здесь мы представляем упрощенный протокол для анализа EV с помощью FC, который может быть применен в предварительно обогащенного образцы, полученные через ultracentrifugation или непосредственно в см (рис. 1). Данный метод использует бисер покрытием с специфическим антителом, которая связывает канонические Exo связанные поверхности epitopes (CD63, CD9, CD81) без дополнительных моет. Анализ ФК может производиться с использованием обычных цитометр без необходимости для корректировки до измерения. Были описаны методы для характеризации антигенов на отдельных мелких частиц, используя поток цитофлуориметрами другими группами в отношении различных приложений11,,12–13. Здесь мы использовали функционализированных магнитные бусы для захвата мелких частиц и Exo, следуют фенотипирование захваченных частиц, ФК. Хотя этот метод может быть использован для характеристики антигенный состав мелких пузырьков, выпущен в любой тип клеток в пробирке, здесь мы предоставили конкретную ячейку культуры условия, которые применяются к культуре человеческого сердца прогениторных клеток (КПК) и наиболее соответствующие условия для производства EV этими клетками.
Protocol
Representative Results
Discussion
Традиционная методика ФК остается наиболее простой аналитический метод характеризовать маркеры, выраженные на поверхность EV. В этой связи выбор наиболее подходящего протокола важно получить полезную информацию об индивидуальных частиц фракций интереса, избегая ограничения из-за чу?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Л.б. была поддержана исследовательских грантов Helmut Horten Stiftung и Velux Stiftung, Цюрих (Швейцария). Г.в. был поддержан исследовательские гранты швейцарского национального научного фонда, Фонда Сесилия-Аугуста, Лугано и SHK Stiftung für Герц und Kreislaufkrankheiten (Швейцария)
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
