Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı
Summary
Protokol hücre kültür supernatants ile kullanılmak üzere tasarlanmış küçük hücre dışı veziküller (EV) üzerinde yüzey epitopları algılamak için tekrarlanabilir yöntemi açıklanır. Yüzey antijeni CD9, tanıyan antikorlar ile CD63 ve CD81 birleştiğinde boncuk kullanarak belirli EV immunoprecipitation kullanır. Yöntem aşağı akım akış sitometresi analizi için optimize edilmiştir.
Abstract
Akış Sitometresi (FC) hücre yüzey antijeni işaretlerinin yarı kantitatif ölçüm için seçim yöntemidir. Son zamanlarda, bu teknik ekstraselüler veziküller (EV) exosomes (dış) periferik kan ve diğer vücut sıvıları da dahil olmak üzere fenotipik analizleri için kullanılmıştır. EV küçük boyutlu bir algılama eşiği çevresinde sahip özel aletlerin kullanımı zorunlu kılar 50-100 nm. Alternatif olarak, EV FC tarafından tespit edilebilir lateks lastikteki ilişkili olabilir. Lastikteki EV ilişkili işaretçileri/küme farklılaşma CD63, CD9 ve CD81 tanımak antikorlar ile Birleşik,-ebilmek var olmak kullanılmış EV yakalama için. Exo CM izole veya ön zenginleştirme olmadan ultrasantrifüj tarafından çözümlenebilir. Geleneksel FC aletler kullanarak EV analizleri için uygun bir yaklaşımdır. Bizim sonuçlar demek floresan yoğunluğu (MFI) değerleri ve EV konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki gösterilmektedir. EV sonication önemli ölçüde bozmakta MFI, yöntemi membran enkaz algılamaz gösteren azalmıştır. Biz herhangi bir laboratuvarda olabilir uygulamaya kolayca EV yüzey antijenleri analizi için doğru ve güvenilir bir yöntem raporu.
Introduction
Hücreleri ekstrasellüler veziküller (EV) microvesicles (MV) ve exosomes (dış) dahil olmak üzere farklı boyutlardaki salgılar. İkinci MV boyutu ve menşe hücre altı yuvası tarafından ayrılır. MV (200-1000 nm boyutunda) plazma zarı dökülme tarafından üst hücrelerden salınır. Tersine, Exo (30-150 nm) ve endosomal membran köken multivesicular organları (MVB) ile hücre zarının1,2sigorta ekstraselüler uzaya serbest bırakılır.
EV vardır giderek tanılama biyolojik de gibi büyük olasılıkla, Onkoloji, Nöroloji, Kardiyoloji ve kas-iskelet hastalıkları3,4,5de dahil olmak üzere birçok alanlarda tedavi aletleri used. Devam eden çalışmalar terapötik ajanlar veziküller ortamdan hücre şartına (CM) tüp bebek kültürlü hücre izolasyon yararlanma gibi EV kullanarak büyük bir çoğunluğu. Mezenkimal kök hücre (MSCs) çeşitli bağlamlarda yararlı etkileri uygulamak ve MSC kaynaklı EV miyokardiyal iskemi/reperfüzyon hasarı6 ve beyin hasarı7modellerinde faydalar göstermiştir. MSC kaynaklı EV ayrıca bağışıklık ret, tedavi etmek için bir terapi-refrakter graft – versus – host hastalığı8modelinde gösterildiği şekilde yararlanılabilir immün düzenleyici faaliyetleri sergi. Amniyotik sıvı kök hücreleri (hAFS) aktif CM MVs ve Exo heterogeneously boyutu (50-1000 nm), hangi hızla çoğalmak-in farklılaşmış hücreler, anjiogenez, fibrozis, inhibisyonu gibi birçok biyolojik etkileri arabuluculuk dağıtılmış, zenginleştirmek ve cardioprotection4. Biz son zamanlarda göstermiştir EV ve özellikle Exo (Exo-TBM) insan kalp kaynaklı progenitör hücreler tarafından salgılanan, fareler5,9miyokard enfarktüsü boyutunu küçültün.
Exo paylaşım proteinler onların yüzeyinde, tetraspanins (CD63, CD81, CD9) ve MHC kompleksi de dahil olmak üzere ortak bir dizi sınıf ı (MHC-ben). Proteinler bu ortak kümesinin yanı sıra, Exo da proteinler özel EV alt yapımcı hücre türü için içerir. Onlar arası hücresel iletişim, böylece birçok biyolojik süreçlerin5,10düzenleyen çok önemli bir rol oynamak çünkü Exo işaretleri büyük önem kazanmaktadır. Küçük boyutlarından dolayı zor bir görev EV klasik akış sitometresi (FC) kalıntıları kullanarak analiz etmek için kolay bir yol bulmak.
Burada, önceden zenginleştirilmiş örnekleri ultrasantrifüj ile elde edilen veya doğrudan CM (Şekil 1) uygulanabilir FC EV analizi için basitleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut. Yöntem kurallı Exo ilişkili yüzey epitopları (CD63, CD9, CD81) bağlar spesifik bir antikor ile kaplı boncuk ek yıkama kullanır. FC analizleri ayarlamalar ölçümleri öncesinde gerek yok ile geleneksel sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Akış cytometers kullanarak bireysel küçük parçacıklar antijenlere karakterizasyonu için yöntemleri diğer gruplar ile ilgili çeşitli uygulamalar11,12,13tarafından tarif edilmiştir. Burada, functionalized manyetik boncuklar küçük parçacıklar ve Exo FC tarafından yakalanan parçacıkların fenotipleme ardından, yakalanması için kullanılır. Her ne kadar küçük veziküller herhangi bir hücre tipi tüp bebek tarafından yayımlanan antijenik kompozisyon tanımlamak için bu yöntem kullanılabilir, burada geçerli olan belirli hücre kültür koşulları kültür insan kalp progenitör hücre (TBM) ve en iyi için verdiğimiz Bu hücreler tarafından EV imalatı için uygun ortam.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel FC teknik EV yüzeyine ifade işaretçileri özelleştirmek için en kolay analitik yöntem kalır. Bu bağlamda, en uygun iletişim kuralını seçme sınırlamaları enstrüman duyarlılık nedeniyle kaçınarak bireysel parçacık kesirler ilgi yararlı bilgiler elde etmek çok önemlidir. Manyetik parçacıklar Exo ve aşağı akım FC uygulama için uygun olan küçük EV yüzey antijenleri tanır antikorlar ile birleştiğinde kullanarak bir yöntemi açıklanmıştır. Biz iki farklı hücre türleri’ni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BANGİN’Helmut Horten Stiftung ve Velux Stiftung, Zürih (İsviçre) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir. G.V. İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, Cecilia-Augusta Vakfı, Lugano ve SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (İsviçre) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
