Preparazione del campione per l'analisi di proteomica massa-spettrometria-basato di microvasi oculari
Summary
Proteoma caratterizzazione dei letti microvascolari oculari è fondamentale per la comprensione approfondita di molte patologie oculari in esseri umani. Questo studio dimostra un metodo efficace, rapido e affidabile per estrazione di proteine e preparazione del campione da piccoli vasi sanguigni che impiegano porcine brevi arterie ciliary posteriori come vasi di modello per le analisi di base di spettrometria di massa proteomica.
Abstract
L’uso dei vasi sanguigni oculari isolati in vitro per decifrare lo stato fisiopatologico dell’occhio utilizzando le più avanzate metodologie ha notevolmente ampliato la nostra comprensione di alcune malattie. Spettrometria di massa (MS)-base proteomica è emerso come un potente strumento per svelare le alterazioni nei meccanismi molecolari e proteina vie nei letti vascolari nella salute e nella malattia di segnalazione. Tuttavia, procedura di preparazione del campione prima dell’analisi MS è cruciale per ottenere risultati riproducibili e approfondita delucidazione del proteoma complessa. Ciò è particolarmente importante per la preparazione di microvasi oculari, dove la quantità di campione disponibile per analisi è spesso limitata e, pertanto, rappresenta una sfida per l’estrazione proteica ottimale. In questo articolo si sforza di fornire un protocollo efficiente, rapido e robusto per la preparazione del campione da un esemplare retrobulbar oculare letto vascolare che impiegano porcine brevi arterie ciliary posteriori. Il presente metodo si concentra sulle procedure di estrazione di proteine dal surnatante e pellet del campione dopo omogeneizzazione, campione di pulizia con dispositivi centrifughi prima unidimensionale gel elettroforesi e peptide di purificazione passaggi per quantificazione privo di etichetta in un liquido cromatografia-electrospray ionizzazione-lineare trappola ionica-Orbitrap MS sistema. Anche se questo metodo è stato sviluppato specificamente per le analisi di proteomica di microvasi oculari, abbiamo anche fornito prove convincenti che può essere prontamente utilizzato anche per altri campioni tissutali.
Introduction
Il progresso nel campo della proteomica, quali permessi integrati e insuperabile potere di raccolta di dati, notevolmente ha rivoluzionato la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di determinate condizioni di malattia anche come riflettendo la stato fisiologico di una cella specifica popolazione o tessuto1,2,3,4. Proteomica ha anche dimostrato di essere una piattaforma importante nella ricerca oftalmica a causa della sensibilità e analisi imparziale di diversi campioni oculari che ha facilitato l’identificazione di potenziali marcatori di malattia per eventuale diagnosi e prognosi, come evidenziato con eleganza da molti studi negli ultimi anni, tra cui alcuni dei nostri1,5,6,7,8,9,10. Tuttavia, spesso è difficile ottenere campioni umani per analisi proteomica per ragioni etiche, soprattutto considerando la necessità di controllo materiale da individui sani per analisi comparative affidabili. D’altra parte, è anche difficile da ottenere una quantità sufficiente di campioni per analisi di spettrometrihe di massa ottimale e affidabile. Ciò è particolarmente importante per la massa limitata materiali biologici quali il micro-vasi sanguigni dell’occhio. Uno tale vaso sanguigno principale retrobulbar che svolge ruoli fondamentali nella regolazione del flusso sanguigno oculare è Arteria ciliare posteriore corto (sPCA). Qualsiasi perturbazione o anomalie in questo letto vascolare possono portare a gravi conseguenze cliniche, che possono portare alla patogenesi di diverse malattie avvistare-minacciosa come glaucoma e nonarteritic neuropatia ottica ischemica anteriore (NAION)11 , 12. Tuttavia, c’è una mancanza di studi delucidando i cambiamenti del proteoma in questo letto arterioso dovuto gli inconvenienti di cui sopra. Di conseguenza, negli ultimi anni, i maiali di casa (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) sono emerso come un buon modello animale nella ricerca oftalmica a causa le somiglianze morfologiche e filogenetiche alte tra esseri umani e suini13, 14,15. Porcini campioni oculari sono facilmente disponibili e la cosa più importante, sono la rappresentazione più accurata di tessuti umani.
Considerando il ruolo importante di questi vasi sanguigni nell’occhio, come pure la scarsità di metodologia era adatta per estrazione della proteina efficiente e analisi da questi microvasi, precedentemente abbiamo caratterizzato il proteoma della sPCA porcina utilizzando un in-House protocollo che ha provocato l’identificazione di un numero elevato di proteine16. Sulla base di questo studio, abbiamo ulteriormente ottimizzato e descritto approfondita la nostra metodologia in questo articolo, che consente analisi del proteoma da piccole quantità di campioni utilizzando la sPCA suina come tessuto di modello. Anche se lo scopo principale di questo studio era di stabilire una metodologia di MS-compatibile per vasi sanguigni oculari di massa limitata, abbiamo fornito evidenze sperimentali che il flusso di lavoro descritto può anche essere ampiamente applicata a vari campioni tissutali.
È prevedibile che questo flusso di lavoro sarà utile per la preparazione di campioni di alta qualità compatibile con MS da piccole quantità di materiali per l’analisi del proteoma completo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Profilatura di proteoma completo di una gamma diversificata di campioni oculare è un primo passo importante e indispensabile per delucidare i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione coinvolte nella salute e nella malattia. Al fine di ottenere dati di alta qualità e per garantire la riproducibilità dei risultati ottenuti da queste analisi, la precedente procedura di preparazione del campione è cruciale, come evidenziato in una recensione da Mandal et che discusso approfondite le procedure di elaborazione del ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam è supportato da interno università ricerca finanziamenti (Stufe 1) dal centro universitario medico dell’Università Johannes Gutenberg di Magonza e una sovvenzione dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
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