Vi rapporterer en enkel og allsidig metode for å utføre fluorescerende live-imaging av Arabidopsis thaliana blader over lengre tid. Vi bruker en transgene Arabidopsis plante uttrykke et fluorescerende reporter gen under kontroll av en immunitet-relaterte arrangøren som et eksempel for å få spatiotemporal forståelse av anlegget immunreaksjoner.
Anlegget immunrespons tilknyttet et genom hele transcriptional omprogrammering startes på stedet av infeksjonen. Dermed reguleres immunrespons romlig og timelig. Bruk med et fluorescerende under kontroll av en immunitet-relaterte arrangøren i kombinasjon med en automatisert fluorescens mikroskopi er en enkel måte å forstå spatiotemporal regulering av anlegget immunitet. I motsetning til roten vev som er brukt i flere forskjellige intravital fluorescerende tenkelig eksperimenter, finnes det noen fluorescerende live bildebehandling eksempler for blad vev som møter en rekke luftbårne mikrobielle infeksjoner. Derfor utviklet vi en enkel metode for å montere blader av Arabidopsis thaliana for live-celle bildebehandling over lengre tid. Vi brukte transgene Arabidopsis planter uttrykke den gule fluorescerende protein (YFP) genefused for kjernefysisk lokalisering signalet (NLS) under kontroll av selskapet med et forsvar markør () Pathogenesis-Related 1 PR1). Vi infiltrert en transgene blad med Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (avrRpt2) belastning (Pst_a2) og utført i vivo tidsinnstilt bildebehandling av YFP for totalt 40 h med en automatisert fluorescens stereomicroscope. Denne metoden kan brukes ikke bare for studier av anlegget immunreaksjoner, men også for analyser av ulike utviklingsmessige arrangementer og miljømessige svar forekommer i blad vev.
Anlegget immunrespons innebærer en dynamisk transcriptional omprogrammering regulert av flere transkripsjon faktorer samt phyto-hormoner1. Oppsamling av transcriptome data gir muligheter for å samle inn informasjon om anlegget immunsystemet: for eksempel nettverkets struktur signalnettverk kaskader2. Vår kunnskap om den romlige og tidsmessige dynamikken i anlegget immunitet er imidlertid fortsatt begrenset3,4,5.
I tidligere studier er spatiotemporal regulering av forsvar genuttrykk hovedsakelig analysert i situ hybridisering og β-glucuronidase (GUS) reporter analysen6,7,8. Disse metodene gir oss å visualisere transcriptional aktivering av ulike gener rundt på stedet. Men disse fremgangsmåtene krever kjemiske fiksering av prøver, og dermed føre til tap av alle timelige informasjon. Biologiske hendelser, for eksempel immunitet, fremgang over tid. Bruk av luciferase som reporter har aktivert erobringen av timelige dynamikken i arrangøren av interesse3. Luciferase-baserte analysen krever imidlertid en kostbar substrat og svært følsom detektorer. For å øke vår forståelse av de spatiotemporal deler av anlegget immunforsvaret ved hjelp av en enkel prosedyre, vi generert transgene Arabidopsis thaliana planter uttrykke gule fluorescerende protein (YFP) genet smeltet til den kjernefysisk lokalisering signal (YFP-NLS) under kontroll av bak forsvar markør genet, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. Vi brukte klorofyll autofluorescence, en markør av levende celler, for å fange prosessen med programmert celledød (PCD), som ofte oppstår under effektor-utløst immunitet (ETI), en form for plante immunitet av bestemte patogen infeksjon9 , 10. overvåking timelige dynamikken fluorescens signal intensitet i fritt flytte objekter som bor Arabidopsis blader, krever en komplekse bildebehandling programvare bygget huset eller tilgjengelig kommersielt. Alternativt, forebygge prøver seg er en enkel metode for å løse problemet. Her utviklet vi en allsidig og enkel metode for montering bor bladene av en transgene Arabidopsis anlegget for langsiktig observasjon under en automatisert fluorescens stereomicroscope. Metoden tillater oss å fange arrangøren dynamikken i jord-vokst intakt anlegget går over et par dager.
Her rapporterer vi en enkel metode å montere en levende Arabidopsis blad uttrykke et fluorescerende reporter gen under kontroll av en formidler av interesse for langsiktig observasjon bruker en automatisert fluorescerende stereomicroscope. Tidsinnstilt bildebehandling av fluorescerende reporter er ofte utført i roten vev; men har bare noen lignende studier vært gjennomført i blad vev. Dette er sannsynligvis fordi bladene er stand til å fritt bevege i rommet, mens røtter er ofte gravlagt og fast i solid agar medium.
I denne rapporten fokuserte vi på spatiotemporal dynamikken i pPR1 aktivitet under ETI indusert av Pst_a2. I tillegg til mild fiksering av bladet beskrevet ovenfor, er det viktig å tydelig visualisere spatiotemporal dynamikken i mobilnettet hendelser som formidler aktivisering og PCD. Hvis forskjellen mellom cellene viser pPR1 aktivitet og PCD ikke er skarpe, sørg for at alle intercellulære områder i infiltrere området er fylt med patogen suspensjon (se trinn 2.4). Dette er viktig når du bruker wide-field fluorescens stereomicroscopes siden disse mikroskop fange alle detectable signaler langs samme loddrette posisjonen til prøven. Klorofyll autofluorescence fra overlevende celler over eller under cellene i PCD domenet masker lett død cellene viser ingen autofluorescence. Dette gjelder også for YFP signal.
Betingelser for tidsinnstilt bildebehandling må etableres nøye gjennom flere innledende eksperimenter under ulike eksperimentelle forhold. Parametere for tidsinnstilt bildebehandling, avhenger av flere faktorer som mikroskopiske systemet, transgene planter og patogener. For å få disse parameterne, analysert vi først ulike eksponeringstider for YFP signal intensitet i infiltrere blad på 7 hpi, som nesten sammenfaller med den første aktiveringen av pPR1. En 5 s avsøring identifiserte avhengig fanger YFP signal med stereomicroscope brukt i denne studien. En lignende test ble utført for imaging klorofyll autofluorescence. Eksponering for prøven lyset mellom 3 min intervaller ble programmert i time-lapse bildebehandlingsprogrammet som vanlig lys feltet bildebehandling med maksimal eksponeringstid. Vårt system (Tabell for materiale) tillater oss å ha 2,5 min i tillegg til YFP, TXR og lys feltet bildebehandling. Denne betingelsen var Hovedgrunnen til å velge et 3 min intervall. Neste, vi bekreftet at denne time-lapse tilstanden forårsaket ingen åpenbar skade plante prøvene, og ikke få ektopisk lette stress-relaterte aktivering av pPR1 (Figur 3B, C). Dette førte til utviklingen av programmet som ble brukt i denne studien. Dermed 3 minutters intervaller av fluorescens imaging anses tilstrekkelig for å fange pPR1 dynamics under Pst_a2-mediert ETI9.
Promotøren-reporter konstruerer, har spesielt med fluorescerende reporter del NLS, vært utnyttet av mange grupper, og er lett tilgjengelig fra forskning samfunnet; Vi brukte den konstruere publisert av Kubo et al. 13. dermed protokollen beskrevet her kan brukes i noen plante biologi Studien undersøker blad vev, hvis riktig transgene planter er tilgjengelig. Vår enkle og lett protokollen gir en flott mulighet for forskere som er opptatt av å analysere spatiotemporal dynamikken i enhver biologiske hendelse som oppstår i blader, som immunforsvaret. Det er sannsynlig at vår metode bruke tape stykker induserer en liten fysisk stress på prøver. Men kan problemet kontrolleres ved å inkludere riktig positive og negative kontroller, for eksempel narr behandlinger, i eksperimenter (Figur 3C). Eksperimentelle forhold kan videre endres og optimalisert ved å analysere disse kontrollene under ulike forhold.
I de senere årene, har raske utviklingen av tenkelig instrumenter og teknikker stimulert interessen av i komplekse spatiotemporal aspekter av biologiske hendelser. I enhver tenkelig analyse er riktig montering og festing av prøvene blant de viktigste spørsmålene. Metoden enkel og allsidig montering levende Arabidopsis forlater utviklet i denne studien kan anvendt og optimalisert for ulike tenkelig eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Japan vitenskap og teknologi Agency [PRESTO117665 til SB, ERATOJPMJER1502 å N.N.] og Japan Society for fremme av vitenskap (Grants-in-Aid for forskning aktivitet oppstart [22880008 til SB] og unge forskere (B) [ 23780040 til SB]). Vi takker A. Senzaki, Y. Suzuki, Y. Sugisawa og E. Betsuyaku for utmerket kundestøtte, J. Parker for gi Pst_a2 belastning og T. Demura for å gi pBGYN vektoren.
Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
BM2 soil | Berger | ||
Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |