곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

요약

다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 ¹³C,¹⁵N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

이 프로토콜 보여줍니다 얼마나 균일 하 게 ¹³C, ¹⁵N 표시 된 곰 팡이 자료 수 생산과 실험 어떻게이 부드러운 소재 고체 NMR 및 감도 향상 DNP 진행 한다. 식물 바이오 매스의 샘플 처리 절차 또한 상세한입니다. 이 방법을 사용 하면 일련의 1d 및 2D ¹³C-¹³C의 측정 /¹⁵N 상관 관계 스펙트럼, 최소한의 섭 동으로 그들의 네이티브 국가에서 복잡 한 생체 재료의 고해상도 구조 설명 있습니다. 동위 원소 라벨 1d 스펙트럼의 강도 및 2D 상관 관계 스펙트럼에 분극 전송 효율을 측정 하 여 시험 될 수 있다. 동적인 핵 분극 (DNP) 샘플 준비의 성공 감도 향상 요인에 의해 평가할 수 있습니다. 다 당 류와 단백질의 구조적 측면을 검토 하는 추가 실험 3 차원 구조의 모델 이어질 것입니다. 이러한 메서드를 수정 및 탄수화물이 풍부한 재료, 식물, 균 류, 조류, 박테리아의 자연 세포 벽을 포함 하 여 뿐 아니라 합성 또는 탄수화물 중합체 및 다른 그들의 복잡 한 디자인의 넓은 범위를 조사 하기 위해 적응 수 있습니다. 분자입니다.

서론

탄수화물은 에너지 저장, 구조 건물, 및 세포 인식 및 접착 등 다양 한 생물학 과정에서 중심 역할을 한다. 그들은 세포 벽에 식물, 균 류, 조류, 박테리아^1,2,3의 기본적인 구성 요소는 농축 됩니다. 세포 벽 역할을 항균 요법^4,,56,7,8 대 유망 대상으로 바이오 연료 및 바이오 소재의 생산에 대 한 중앙 소스 ^{, 9}.

이러한 복잡 한 자료의 현대 이해는 수 십년의 4 개의 주요 생 화 확 적인 또는 유전자 방법을 사용 하 여 구조적 특성에 전념 했다 노력에 의해 실질적으로 고급 되었습니다. 첫 번째 주요 방법 의존 순차적 치료 가혹한 화학 물질이 나 효소를 사용 하 여 다른 부분으로 세포 벽을 무 너 뜨 리는 뒤에 작....

프로토콜

1. ¹³C, ¹⁵N 표시 Aspergillus fumigatus 성장의 액체 매체

1. 레이블이 없는의 준비와 ¹³C, ¹⁵N 표시 된 성장 매체
   참고: 모두 효 모 추출 물 펩 포도 당 매체 (YPD)와 향상 된 최소한의 중간⁴³ 곰 팡이 문화 유지 관리를 위해 사용 되었다. 압력가 마로 소독 후 모든 단계는 오염을 최소화 하기 위해 층 류 후드에서 수행 됩니다.
   1. 레이블이 없는 액체 매체의 준비: 6.5 g 100 mL의 증류수 그리고 134 ° c.에 25 분 압력솥에 YPD 분말의 분해
   2. 레이블이 없는 단단한 매체의 준비
      1. 100 mL의 증류수에 한 천의 YPD 분말 6.5 g 1.5 g을 추가 합니다.
      2. 고압 121 ° C 그리고 멋진 약 50 ° c.까지 25 분 매체
      3. 각 미리 살 균 플라스틱 페 트리 접시에 매체의 13-15 mL을 전송 하 고 즉시 뚜껑을 사용 하 여 요리를 커버.
   3. ¹³C, ¹⁵N 표시 된 액체 매체의 준비
      참고: 동위 원소 라벨,

결과

실질적으로 NMR 감도 강화 하 고 2D ¹³C-¹³C와 ¹³C-¹⁵N 상관 관계 스펙트럼 분석 구성, 수 화, 이동성을 일련의 측정 및 포장의 가능 하 게 동위 원소 라벨 중합체 세포 벽 구조 (그림 1)의 3 차원 모델을 생성 하는 통합 된 것입니다. 성공 하면 균일 한 라벨 1 D ¹³C와 ¹⁵N 스펙트럼의 완전 한 세트는 1 시간 이내 수령 하실 수 없습니다 그리고 각 표준 2D 스펙트럼 측정의 24 시간 보다 더 이상 걸릴 해야 합니다.

잘 준비 된 샘플은 일반적으로 모두 높은 NMR 농도 기대 하 고 날카로운 라인. 변수 매개 변수의 손상 되지 않은 최적화 된 샘플 준비를 나타냅니다........

토론

생 화 확 적인 방법에 비해, 고체 NMR 장점이 아닌-파괴 및 고해상도 기술로. NMR 작곡 분석, 양적 이며 또한 대부분의 다른 분석 방법과 달리 않습니다는 불확실성에 의해 소개 되지 biopolymers의 한정 된 가용성. 현재 프로토콜의 탄수화물이 풍부한 바이오 소재 및 기능성된 고분자에 대 한 미래의 연구를 촉진 한다. 그러나, 그것은 유의 공명 할당 및 데이터 분석 시간이 많이 소요 될 수 있습니다 및 일반적으로 체계적인 훈련을 요구 하십시오. 저자는 현재 개발 도구가이 장애물을 극복 하기 위해 사전 경험 없이 과학자 수 있도록 데이터베이스.

¹³C의 자연 동위 원소 풍부 1.1%만 이기 때문에, 관찰 하는 ¹³C-¹³C 피크 재료 레이블 없음 사용 하 여 크로스 확률이입니다만 0.012% (1.1 x 1.1%)를 사용 하 여 균일 하 게 샘플을 표시. 따라서, 실질적으로이 프로토콜을 사용 하 여 달성 하는 동.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암모늄 몰리브덴 데이트 테트라하이드레이트	Acros Organics	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
분석 계량 저울	Ohaus	B730439218	모델 PA84C
Bioclave 16 L	VWR	470230-598
Biosafety Cabinet	Labconco corporation	302319100
Boric acid	VWR	BDH9222	15-30 °에 매장; C
코발트 (II) 염화물 육수화물	Honeywell|플루카	60820	≥ 98 %
구리 (II) 황산염 5 수화물	BDH	BDH9312	≥ 98 %
코닝 LSE 진탕 인큐베이터	Thermo Fisher Scientific	7202152
D2O	시그마 Aldrich	151882	99.9 원자 % D
d6-DMSO	시그마 Aldrich	151874	99.9 원자 % D
d8-glycerol	시그마 Aldrich	447498	≥ 99 원자 % D
투석 튜빙 3.2 kDa	시그마 Aldrich	D2272	132724
인산 디칼륨	VWR	BDH9266	≥ 98 %
글리세롤	시그마 Aldrich	G5516	≥ 99.5 %
Heraus Megafuge 16R 원심분리기	Thermo Fischer Scientific	750004271	Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS 일회용 인서트 키트	Bruker	B4493	Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Alfa Aesar	14498	≥ 99+ %
황산 마그네슘 헵타 하이드레이트	VWR	10034998	18-26 °에 저장; C
망간 (II) 염화물 테트라 하이드레이트	Alfa Aesar	11563	≥ 99 %
모노포타슘 포스페이	VWR	470302-254	≥ 99 %
pH 미터	Mettler Toledo	B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate	Acros Organics	13235-36-9	≥ 99.5 %
아연 황산염 헵타하이드레이트	알파 에자르	33399	≥ 98 %
12C3, d8-glycerol	케임브리지 동위원소 연구소	CDLM-8660	12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-포도	시그마 Alrdrich	364606	≥ 99 % (CP)
15N-질산나트륨	시그마 알드리치	364606	≥ 98 % 15N, ≥ 99 (cp)
3.2mm 사파이어 NMR 로터	Cortecnet	B6939
3.2mm 실리콘 플러그	Bruker	B7089
4mm MAS 로터 키트	Bruker	H14355	지르코니아

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