극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포

Summary

xylem 내의 물 분포를 관찰하면 우디 식물의 물 흐름 역학에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 이 연구에서는 시료 준비 중 물 상태의 실제 적 변화를 제거하는 저온 유지 및 저온 SEM을 사용하여 현장에서 자일렘 물 분포를 관찰하는 실용적인 접근 법을 보여줍니다.

Abstract

스캐닝 전자 현미경 설치 저온 장치(cryo-SEM)는 영하의 온도에서 시편 관찰을 가능하게 하며 액체 질소(LN)를 _{이용한 동결 고정 기술과 함께 식물 조직의 물 분포를 탐색하는 데 사용되어 왔습니다.} 2). 우디 종의 경우, xylem 가로 절단 표면을 관찰하기위한 준비는 나무 섬유의 배향으로 인해 몇 가지 어려움을 수반한다. 또한, 자일렘 도관의 물 기둥의 높은 장력은 특히 샘플 고정 및 수집 중에 물 분포에 예술적 변화를 일으킬 수 있습니다. 본 연구에서, 우리는 저온 극저온 및 저온 -SEM을 사용하여 현장에서 우디 식물의 자일렘 내에서 물 분포를 관찰하는 효율적인 절차를 입증한다. 처음에, 샘플 수집 하는 동안, 자일렘 물 전위를 측정 하는 높은 장력이 자일렘 도관에 존재 여부를 결정 한다. 자일렘 물 전위가 낮을 때(ca. -0.5 MPa), 시료 동결 고정 중에 자일렘 도관에서 물 상태를 더 잘 보존하기 위해 장력 완화 절차가 필요합니다. 다음으로, 나무 줄기 주위에 방수 칼라가 부착되고 자일렘의 물 상태의 동결 고정을 위해 LN 2로 채워져 있습니다. 수확 후, 관찰을위한 샘플 준비 절차를 완료하는 동안 샘플이 동결 보존되도록주의를 기울여야합니다. 실렘 가로 절단 표면을 명확하게 노출시키기 위해 저온 극저온이 사용됩니다. 저온-SEM 관측에서, 동결 에칭을 위한 시간 조정은 서리 먼지를 제거하고 보기 표면에 세포벽의 가장자리를 강조하기 위하여 요구됩니다. 우리의 결과는 세포 및 세포 이하 수준에서 자일렘 내의 물 분포의 관찰을 위한 저온-SEM 기술의 적용성을 보여줍니다. 극저온-SEM과 비파괴적 관측 기법의 조합은 우디 식물의 물 흐름 역학의 탐사를 심오하게 향상시킬 것입니다.

Introduction

수자원의 가용성 (즉, 강수량, 토양 수분 함량)은 토양에서 물을 흡수하고 광합성 생산을 위해 잎으로 운반해야하기 때문에 식물 종의 사망률과 지리적 분포를 엄격하게 결정합니다. 플랜트는 변동하는 물 공급 하에서 물 수송 시스템을 유지해야 합니다. 특히, 우디 식물은 증발 스트림을 따라 자신의 도관에 높은 장력을 생성, 어떤 경우에는, 그들은 지상 ~ 100m 이상 자신의 크라운을 개최해야합니다. 이러한 높은 음압 하에서 물 기둥을 유지하기 위해 자일렘 도관은 단단하고 소수성 결찰 된 세포벽^1을가진 관형 세포의 연속체로 구성됩니다. 각 종에서 자일렘 도관의 자일렘 기능 장애에 대한 취약성은 변동하는 물 공급 하에서종 생존의 좋은 결정자이다 2. 또한, 자일렘 도관의 물 상태를 연구하는 것은 비생물성 또는 생체 학적 응력을 받는 개별 나무의 건강 상태를 평가하는 데 중요합니다. 수액 유량 또는 물 전위를 측정하면 자일렘 도관의 통합 유압 기능으로 인해 우디 플랜트의 물 상태를 추정할 수 있습니다. 또한, 자일렘 셀에서 물의 분포를 시각화하면 자일렘 유압 시스템의 개별 구성 요소의 상태를 명확히 할 수 있습니다.

자일렘 도관의 물 상태를 시각화하기위한 몇 가지 기....

Protocol

참고: 이 프로토콜의 회로도 차트는 그림1에 나와 있습니다.

1. 샘플링 : 자일렘 도관의 물 기둥 내에서 긴장 완화

참고: 다음 장력 이완 처리는 LN₂ 적용 전에 실렘 물 분포에서 동결 및 장력 유도 아티팩트를 모두 피하기 위해 권장됩니다.

1. 분기를 동봉하고 자일렘과 샘플링 하기 전에 2 시간 이상 잎 사이의 물 잠재력을 평형 검은 비닐 봉지와 샘플링 을 위해 잎.
2. 압력 챔버 또는 사이크롬터를 사용하여 샘플로부터 적어도 2개의 잎의 물 전위를 결정한다. 물 전위가 ca. -0.5 MPa(즉, 없음 또는 매우 낮은 장력이 존재함)보다 높을 때, 시료는 동결 후 수확될 수 있다(섹션 2: 동결 고정참조). 물 전위가 -0.5 MPa보다 낮으면 아래에 설명된 대로 이완을 위한 치료가 필요합니다.
3. 물로 채워지려면 줄기 주위에 방수 칼라를 고정하십시오. 바닥이없는 플라스틱 컵은 방수 칼라역할을 할 수 있습니다. 이후에 사용되는 액체 매체의 누출을 방지하기 위해 끈적끈적한 테이프를 사용하여 스템과 칼라 사이의 공간을 단단히 밀봉하는 데 주의를 기울여야 합니다. ....

Results

극저온-SEM에 의해 관찰된 응비및 활엽수 자일렘의 가로 절단 표면의 대표적인 이미지는 그림2에 나와 있다. 낮은 배율에서 이미지의 검은 영역은 물이 완전히 또는 부분적으로 사라지는 구멍을 나타내고 회색 영역은 자일렘 세포벽, 세포질 및 물을 나타냅니다(그림2A). 높은 배율에서, 물은 3개의 기관지의 루미나로부터 완전히 손실되지 않는 것이 명백하며, 이는 현장에서 자일렘 수액에서 매크로 기포의 발생을 나타낸다(그림2B). 광엽 종에 대하여, 캐비테이션 발생은 혈관 내에서 쉽게 검출되는 반면, 물의 존재는 섬유 내에서 구별하기 어려운 반면, 특히 낮은 배율에서 (그림2C).

Discussion

이 백서에 소개된 극저온-SEM 관찰 방법은 세포 규모의 물 분포를 명확하게 시각화하는 데 실용적입니다. 이 방법을 통해 자일렘 내의 물 분포의 변화를 탐구하는 것은 잠재적으로 비생물적 스트레스 (물 부족 또는 동결) 또는 생물학적 스트레스 (나무 질병)에 대한 수종 내성의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법의 가장 중요한 단계는 샘플 수집 및 후속 샘플 준비 중에 기본 물 상태의 물 분포 특성을 보존하는 것입니다. 긴 도관 (특히 고리 다공성 나무의 초기 목재 용기)가있는 종의 자일렘 조직은 수확 및 동결 중에 물을 쉽게 잃을 수 있습니다. Cochard et al. (2000)는 자일렘 도관^38,41을따라 물 기둥의 높은 장력으로 인해 동결 유물을 논의하였다. 우메바야시 외(2016)는 비파괴 MRI 관측값^39와

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
코팅 재료	JOEL Ltd., 일본	골드 와이어, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, 부품 번호 125000499
	MP-Z09085T / MP-51020ALS 저온 유지 장치가 설치된 JSM-6510 JSM-6510