Nous présentons ici un protocole permettant de combiner deux techniques traitement échantillon haute pression gel et traitement des échantillons assistée par micro-ondes, suivie de minime résine enrobage d’acquisition de données avec un microscope électronique à balayage faisceau ionique focalisé (FIB-SEM). Cela est démontré à l’aide d’un échantillon de nerf tibial de souris et le Caenorhabditis elegans.
La technique de préparation d’échantillon décrit est conçue pour combiner la meilleure qualité de préservation avec le contraste plus approprié pour le système d’imagerie dans un ionique focalisé faisceau microscope électronique à balayage (FIB-SEM), qui permet d’obtenir piles d’images séquentielles pour la reconstruction 3D et modélisation. Haute pression gel (HPF) permet à près de préservation structurelle native, mais la cryo-substitution souvent ne fournit pas un contraste suffisant, surtout pour un échantillon plus grand, ce qui est nécessaire pour l’imagerie de haute qualité dans le SEM requis pour la 3D reconstruction. Par conséquent, dans ce protocole, après la substitution de gel, étapes contrastées supplémentaires sont effectuées à température ambiante. Bien que ces étapes sont réalisées dans un four à micro-ondes, il est également possible de suivre un traitement banc traditionnel, qui nécessite des temps d’incubation plus longues. L’intégration ultérieure dans des quantités minimes de résine permet plus rapide et plus précis de ciblage et de préparation à l’intérieur le FIB-SEM. Ce protocole est particulièrement utile pour les échantillons doivent être préparés par un gel à haute pression pour une préservation fiable, mais n’obtiennent pas un contraste suffisant lors de la substitution de gel pour l’imagerie de volume à l’aide de FIB-sem En combinaison avec l’incorporation de résine minime, ce protocole prévoit un workflow efficace pour l’acquisition de données de volume de haute qualité.
Gel à haute pression est le procédé de préparation d’échantillon de choix pour l’obtention de préservation haute qualité, qui représente l’état natif d’un échantillon beaucoup mieux que les méthodes classiques de préparation à l’aide de fixation chimique1. Cette méthode de cryo-préparation est utile pour les échantillons tels que souris myélinisées tissus2 et une stricte obligation d’utiliser l’organisme modèle Caenorhabditis elegans3. Après Cryo-substitution et incorporation de résine, ces échantillons sont généralement analysés par microscopie électronique à transmission (TEM) ou la tomographie électronique (he). Si les plus gros volumes doivent être copiés à l’aide de FIB-SEM ou l’îlot série imagerie pour les reconstructions 3D haute résolution à grande échelle, selon notre expérience, l’imagerie appropriée par SEM est souvent entravé par le manque de contraste. Dans le FIB-SEM, l’image est généralement enregistrée par la détection des électrons rétrodiffusés par le faisceau d’électrons primaires. Le rendement en électrons rétrodiffusés est proportionnel à la teneur en métaux lourds dans l’échantillon. Par conséquent, protocoles ont été spécialement conçus pour volume d’imagerie pour renforcer le contraste par imprégnation d’autres métaux lourds. Ces méthodes reposent sur des échantillons fixes chimiquement et appliquent une combinaison de tétroxyde d’osmium-thiocarbohydrazide-tétroxyde d’osmium4, tel que décrit par Knott et coll.5, pour série îlot et axé sur le faisceau d’ions de microscopie électronique à balayage. Modifications, y compris l’utilisation de formamide et le pyrogallol6 ou plomb aspartate7 ont été appliquées avec succès pour les différentes techniques d’imagerie.
Le protocole fourni ici combine la cryo-préparation d’échantillons par HPF et Cryo-substitution avec ultérieures de traitement pour un contraste amélioré à l’aide de thiocarbohydrazide/osmium dans l’acétone à la température ambiante assistée par micro-ondes. Nous démontrons cela sur le jambier nervus myélinisées de souris et chez Caenorhabditis elegans, qui représentent des échantillons nécessitant une haute pression gel de qualité préservation. En outre, il est montré comment, après l’infiltration et la déshydratation, les échantillons sont intégrées avec comme peu de résine que possible. Cette minime résine enrobage8 permet un ciblage plus rapide de la structure d’intérêt et réduit le temps consacré au traitement des échantillons, y compris le moins de temps requis pour l’exposition de la région d’intérêt avec le faisceau d’ions. Après avoir effectué plus d’étapes de préparation d’échantillon à l’intérieur du microscope, d’imagerie et de broyage de l’échantillon sont effectué en permanence afin d’acquérir une pile d’images. Pour visualiser en 3D, logiciels (IMOD) est utilisé pour reconstruire les parties de l’objet dataset.
Notre flux de travail décrit comment le contraste entre le plus approprié des échantillons pour l’imagerie de volume peut être combinée avec la meilleure préservation de HPF et la cryosubstitution. Ceci est utile pour les échantillons qui exigent strictement cryo-préparation. Les applications sont limitées aux petits échantillons qui peuvent être préparés par HPF. Dans des échantillons de nature différente, tels que le matériel végétal ou de micro-organismes, ce protocole nécessite une adaptation.
Le protocole a été développé afin d’illustrer la préservation optimale et le contraste pour effectuer l’imagerie série îlot avec un FIB-sem Donc, nous avons choisi d’appliquer la cryo-immobilisation suivie après coloration à l’aide de Cryo-substitution et traitement assistée par micro-ondes. Par conséquent, ce protocole est limité à des échantillons qui sont assez petits pour gel haute pression. Les limitations de taille de 3 à 6 mm de largeur et épaisseur de ~ 200 µm sont établis par la taille de la porteuse de l’échantillon, qui correspond à la taille de l’échantillon qui se congèle bien avec cette technique. C’est pertinent pour l’échantillon de nerf des souris, car le nerf sciatique est trop grand en diamètre pour s’insérer dans les entreprises de 0,2 mm qui sont nécessaires pour assurer la bonne congélation. Par conséquent, une dissection minutieuse d’un nerf plus petit tels que le nerf tibial ou autres nerveuses minces comme le nerf fémoral est recommandée. La gaine de myéline étant sensible à l’étirement, grand il faut au cours de la dissection du nerf fraîche et viable pour éviter de gérer des artefacts. En général, seuls les échantillons viables doivent servir pour des études en microscopie électronique.
Traitement assistée par micro-ondes et minime résine enrobage sont conçus pour accélérer la préparation et le ciblage des processus. Le traitement assistée par micro-ondes appliquant un OTO mis à jour le protocole n°4 est utilisé pour la température de la pièce de fixation chimique. Un four à micro-ondes domestique produira pas les mêmes résultats, puisqu’il n’y a aucune répartition homogène des micro-ondes, sa température n’est pas contrôlée, et il n’y a pas de vide qui peut être appliqué. Le plus petit un échantillon, la meilleure pénétration des produits chimiques ; par conséquent, les meilleurs résultats sont obtenus par plus petits échantillons. Pour éviter d’endommager l’échantillon par la surchauffe, contrôle de température et de la demande de la puissance du micro-ondes minimum requis sont essentiels. Les étapes de traitement assistée par micro-ondes sont possibles sur le banc, s’il n’y a pas de micro-ondes disponibles, qui conduira à des délais de traitement plus longs. Aux structures de cible directement dans le SEM, il est crucial de retirer autant résine que possible sur le dessus de l’échantillon. Après l’enregistrement d’un dataset, le post-traitement des données brutes est nécessaire pour réduire la taille du fichier et améliorer le rapport signal-bruit. Les techniques d’imagerie modernes volume produisent de grandes quantités de données. Par conséquent, pour effectuer le traitement des données de manière rapide et suffisante, suffisamment de RAM sur le poste de travail est nécessaire. Pour les opérations d’alignement au moins deux fois plus de RAM que la taille du groupe de données est nécessaire.
Ce protocole a été testé sur le jambier nervus de la souris ainsi que dans c. elegans. Hall et al.. 12 a utilisé une mesure semblable de mise en valeur après leur remplacement de gel sur le banc pour la préparation de elegans de c. Pour tout autre organisme modèle tels que le poisson-zèbre, ajustement au protocole est probablement nécessaires. Une seule modification possible consiste à modifier la composition de la substitution de gel cocktail, tels que par l’addition de l’eau qui est utilisée pour contrast enhancement18. En outre, la durée de la substitution de gel doit être adapté à l’échantillon et peut être considérablement raccourcie selon la congélation rapide substitution protocole19. Une possibilité est l’application d’agitation pour accélérer le gel substitution processus20. Après la substitution de gel, plus les modifications sont possibles, telles que l’application répétée d’améliorer des produits chimiques et le tétroxyde d’osmium21. Au cours du traitement de four à micro-ondes, la température, temps d’incubation et des paramètres d’énergie peuvent varier pour optimiser les résultats pour l’échantillon respectif.
Ce protocole indique qu’une telle amélioration est cumulable avec d’autres protocoles de substitution de gel et les différents types d’échantillons tels que décrits par Hall12 qui sont imagés dans un FIB-SEM ou par microscopie électronique à balayage série îlot. Ces techniques d’imagerie requièrent un contraste amélioré, qui est moins important pour la microscopie électronique à transmission.
The authors have nothing to disclose.
Le FIB-SEM et A.S. (la position de l’opérateur de FIB-SEM) sont financés par le Cluster d’Excellence et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center Nanoscale microscopie et la physiologie moléculaire de la cerveau (CNMPB). Nous remercions le laboratoire de Thomas Müller-Reichert pour fournir des échantillons d’elegans de c. . Nous remercions Ulrich Weikert pour sa participation dans le film.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |