JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Directe inspuiting van een lentivirale Vector hoogtepunten meerdere Motor trajecten in het ruggenmerg Rat

Published: March 15, 2019
doi:
10.3791/59160
, , , ,
1Shriner’s Pediatric Research Center,Temple University

Summary

Dit protocol toont injectie van een retrogradely vervoerbare virale vector in rat ruggenmerg weefsel. De vector is overgenomen in de synaps en vervoerd naar de cel lichaam van doel neuronen. Dit model is geschikt voor retrograde tracering van belangrijke spinale trajecten of targeting cellen voor gen-therapie-toepassingen.

Abstract

Invoering van proteïnen van belang in cellen in het zenuwstelsel is uitdagend als gevolg van aangeboren biologische barrières die de toegang tot de meeste moleculen beperken. Injectie rechtstreeks in het ruggenmerg weefsel omzeilt deze belemmeringen, toegang tot cel organen of synapses waar moleculen kunnen worden opgenomen. Virale vector technologie combineren met deze methode zorgt voor het binnenbrengen van doelgenen zenuwweefsel ten behoeve van gentherapie of tractus tracering. Hier is een virus dat is ontworpen voor zeer efficiënte retrograde vervoer (HiRet) geïntroduceerd op de synapsen van propriospinal interneuronen (PNs) ter bevordering van specifieke vervoer naar neuronen in het ruggenmerg en de kernen van de hersenstam. Gericht op de PNs profiteert van de talrijke verbindingen die zij van motor trajecten zoals de rubrospinal en reticulospinal traktaten, evenals hun interconnectie met elkaar hele segmenten van het ruggenmerg ontvangen. Representatieve tracering met behulp van de vector HiRet met de constitutively actieve groen fluorescente proteïne (GFP) toont HiFi details voor cel organen, axonen en dendritische arbors in thoracale PNs en in de reticulospinal neuronen in de pontine Formatio vorming. HiRet integreert goed in de hersenstam trajecten en PNs maar toont van de leeftijd afhankelijke integratie in corticospinal tract neuronen. Kortom is ruggenmerg injectie met behulp van virale vectoren een geschikte methode voor het binnenbrengen van neuronen van gerichte traktaten van proteïnen van belang.

Introduction

Virale vectoren zijn belangrijke biologische hulpmiddelen die genetisch materiaal kunnen introduceren in cellen om te compenseren voor defecte genen, upregulate belangrijke groei eiwitten of marker eiwitten die wijzen op de structuur en de synaptische Connecties van vervaardiging hun doelstellingen. Dit artikel richt zich op directe injectie van een zeer efficiënte retrogradely vervoerbare lentivirale vector in het ruggenmerg rat om te benadrukken grote motor trajecten met fluorescerende tracering.  Deze methode is ook zeer geschikt voor axonale regeneratie en hergroei studies te introduceren van proteïnen van belang in diverse populaties van neuronen en heeft geweest tweedehands voor zwijgen neuronen voor functionele toewijzing studies1,2.

Veel van de anatomische details voor spinale motor trajecten werden toegelicht door middel van directe inspuiting studies met klassieke traceurs zoals BDA en fluoro-goud3,4,,5,,6,7 , 8. deze verklikstoffen worden beschouwd als gouden standaard maar wellicht bepaalde nadelen zoals opname door beschadigde axonen of axonen in de passage in de witte stof rondom een injectie site9,10,11 . Dit kan kan leiden tot onjuiste interpretaties van traject connectiviteit en een nadeel in regeneratie studies waar de kleurstof absorptie door beschadigd of afgehakte axonen voor het regenereren van de vezels tijdens latere analyse12kon vergissen.

Lentivirale vectoren zijn populair in gen therapie onderzoeken, zoals zij stabiele expressie in neuronale populaties13,14,15,16,17,18 leveren ,19. Echter, traditioneel verpakte lentivirale vectoren kunnen hebben beperkte retrograde vervoer en kan leiden tot immuunsysteem reactie wanneer gebruikt in vivo4,20,21. Een uiterst efficiënte retrograde vervoer vector genoemd HiRet opgesteld door Kato et al. door aanpassing van de virale envelop met een rabiës virus glycoproteïne maken een hybride-vector die retrograde vervoer22,23 verbetert.

Retrograde tracering introduceert een vector in de synaptische ruimte van een target neuron, waardoor het te worden in beslag genomen door de axon van die cel naar de cel lichaam vervoerd. Succesvolle vervoer van HiRet is gebleken uit de neuronale synapsen in de hersenen van muizen en primaten23,24 en de spier in motorische neuronen22. Dit protocol toont injectie in de lumbale ruggemerg, specifiek gericht zijn op de synaptische terminals van propriospinal interneuronen en hersenstam neuronen. PNs ontvangen van verbindingen van vele verschillende spinale routes en kunnen dus worden gebruikt om een diverse bevolking van neuronen in het ruggenmerg en hersenstam richten. Gelabelde neuronen in deze studie vertegenwoordigen schakelingen innervating motor neuron zwembaden met betrekking tot stuk motor functie. Robuuste labeling is te zien in het ruggenmerg en hersenstam, met inbegrip van high-fidelity details van dendritische arbors en axon terminals. Wij hebben deze methode ook gebruikt in eerdere studies binnen het cervicale ruggenmerg aan het label propriospinal en hersenstam reticulospinal trajecten25.

Dit protocol toont injectie van een virale vector in de lumbale ruggemerg van een rat. Zoals te zien in de film 1, wordt de incisie wordt gericht door het identificeren van de L1 wervel attractiepark van de laatste rib. Dit wordt gebruikt als een caudal mijlpaal voor een incisie voor 3-4 cm die de daaraan gehechte spiermassa over het ruggenmerg L1-L4 bloot. Laminectomies van de dorsale aspecten van de wervels T11-T13 worden uitgevoerd en een schuine glazen naald is gericht 0.8 mm lateraal van de middellijn en verlaagde 1,5 mm diep in de grijze stof te injecteren van virus.

Protocol

Alle volgende chirurgische en dierlijke verzorging procedures zijn goedgekeurd door de zorg van het dier en gebruik Comité van Temple University. 1. vooraf chirurgische preparaten Bereiden getrokken glas naalden voor virale injectie een paar dagen voor de ingreep met behulp van 3,5 nanoliter glazen capillaire pipetten ontworpen voor nanoliter injectoren. Trek elke pipet op een trekker naald in twee stappen volgens de instructies van de fabrikant om twee naald-sjablonen te maken.</li…

Representative Results

Succesvolle injectie en vervoer van de virale vector moeten resulteren in signaaltransductie van een robuuste bevolking van unilaterale neuronen in het ruggenmerg, en in bepaalde kernen van de hersenstam. Figuur 1 toont de stereotiepe etikettering van neuronen en axonen in het thoracale ruggenmerg en in de pontine Formatio vorming van de hersenstam op vier weken na injectie. Belangrijke GFP expressie wordt gezien in de neuronen in de grijze stof van het thoracale ruggenme…

Discussion

Genetische manipulatie van neuronen in de hersenen en het ruggenmerg heeft gediend om te markeren zintuiglijke, motorische en autonome trajecten via fluorescerende tracering en hergroei mogelijkheden verkennen van neuronale traktaten na letsel27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. directe injectie v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Institute of Neurological Disorders en beroerte R01 R01NS103481 en het Shriners ziekenhuis voor pediatrisch onderzoek verleent SHC 84051 en SHC 86000 en het ministerie van defensie (SC140089).

Materials

#10 Scalpel Blades Roboz RS-9801-10 For use with the scalpel.
1 mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309659 For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309604 For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture DemeTECH NN374-16 To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler World Precision Instruments 32416 Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution Purdue Products L.P. L01020-08 For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol N/A N/A For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) Zoetis 240048 For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin) West-Ward Pharmaceuticals NPC 0143-9924-90 To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer CellPoint 5-1450 To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax Fine Science Tools 19009-00 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer Fine Science Tools 18010-00 To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale Okaus REV.005 For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment World Precision Instruments MF34G-5 For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam Pfizer H68079 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes World Precision Instruments 4878 For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers Oster 111038-060-000 For clearing the surgical site of hair.
Hemostats Roboz RS-7231 For general use in surgery.
Kimwipes Kimtech 34155 For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps Roboz RS-5136 For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale Kanetec N/A For precise targeting during surgery.
Microscissors Roboz RS-5621 For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular Leitz Wetzlar N/A Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments 62403 To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector World Precision Instruments 500150 To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller Narishige PC-100 To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment Dechra Veterinary Products RAC 0119 To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm Bemis PM-996 To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton, Dickinson and Company 305122 For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps Roboz RS-5152 For griping spinous processes.
Red Oil N/A N/A To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors Roboz RS-6510 To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets Bio Serv MP275-050 For pain management post-surgery.
Rongeurs Roboz RS-8300 To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle Roboz RS-9843 To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors Roboz RS-5980 For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips CellPoint 201-1000 To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps Kent Scientific INS750347 To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth Phenix Research Products BP-989 To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators Puritan 806-WC To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze Covidien 2146 To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline Baxter Healthcare Corporation 281324 For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves N/A N/A For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad N/A N/A For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope N/A N/A For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler Kent Scientific INS750546 To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump Gaymar TP500C To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad Baxter Healthcare Corporation L1K018 For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks N/A N/A To hold open the surgical wound.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley’s anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. 신경과학. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

Tags

Lentiviral VectorSpinal CordMotor PathwaysViral VectorGenetic MaterialNeural CircuitsDirect InjectionL1 To L4 Spinal LevelsMicromanipulatorAnesthetized RatSkin IncisionSpinous ProcessesRat Tooth Forceps
check_url/kr/59160?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord. J. Vis. Exp. (145), e59160, doi:10.3791/59160 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image