準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色
Summary
マウス小脳・髄鞘形成と中枢神経系検査のメカニズムを調査するため適切な免疫組織化学的染色ミエリン鞘からスライス培養切片を準備する方法をご紹介します。
Abstract
ミエリンは神経系、グリア髄によって生成された複合膜構造細胞、どの ensheathes 軸索と高速電気伝導を容易に。ミエリンの変質は、機能的障害に関連付けられているが、様々 な神経疾患で発生する示されています。ここで、元の詳細な説明は提供 vivo マウス脊髄小脳スライス、いくつかの数週間、さらにラベルを貼ってミエリンを視覚化するために文化で維持できるから成る。
Introduction
ニューロンは、その環境と生成と他の細胞に電気的な刺激の伝達を保証する軸索からの入力を受け取る樹状の区画を占める高偏極のセルです。急速な伝播と情報のタイムリーな配信は、神経系の適切な機能のために不可欠です。脊椎動物、それは軸索伝導速度1を増加できるの髄鞘によって促進されます。髄鞘は、すなわち中枢神経系 (CNS) におけるオリゴデンドロ サイトおよび末梢神経系 (PNS) にシュワン細胞髄グリア細胞によって生成される膜の圧縮された層によって形成された特殊な構造です。中枢神経系と、PNS の両方で、axoglial 相互作用ドライブ軸索の専門領域の形成: Ranvier のノードとその周辺のドメイン、paranodes、および juxtaparanodes2。髄鞘、節間、電位依存性ナトリウム チャネル (Nav) の濃縮小さな無髄ドメインに対応している Ranvier のノードと代替絶縁軸索のセグメントです。高濃度と Ranvier のノードで Navチャネルの急速な活性化、活動電位と一緒にミエリン鞘の絶縁の特性の再生、効率的かつ高速跳躍伝導を確保、3軸索に沿って神経インパルス。
神経インパルスの伝導速度を加速する上で、その役割のほか髄グリア細胞は軸索、その長期的な整合性を確保してその生存4,5に参加する代謝サポートを提供します。さらに、明らかになったで近年そのミエリンが動的に従っておそらく規制とさまざまな神経システム機能の可塑性に参加して、生涯変調します。分布、数、長さ、および軸索に沿って髄鞘の太さの調整可能性がありますつまりさまざまなネットワーク6,7、8を微調整する斬新な方法を表します。したがって、ミエリンの進化的獲得は感覚、運動および認知機能の重要なプロセスと軸索とグリアの相互作用摂動をますます発達への貢献として考慮するか神経を取得疾患9。
脂質 (70%) の割合が高いの特定の機能を持つ、ミエリン組成を特徴づけられています。タンパク質 (30%) と比較してください。対照的に他の細胞内膜系の10。しかし、ミエリン脂質とは異なりミエリン蛋白のほとんど、髄鞘、ミエリン塩基性タンパク質 (MBP)、ミエリンプロテオリピドタンパク質 (PLP)、2’、3′ 環状ヌクレオチド 3′-ホスホジエステラーゼ (CNP)、ミエリン関連糖蛋白 (MAG) などに特化ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ)、PMP 22、P010。髄鞘を染色するさまざまな組織学的方法はルクソールの高速青11などの脂質組成スーダン黒い B12ベイカーの酸ヘマチン法13と同様、14を汚す銀に基づいて存在しています。それにもかかわらず、これらのアプローチでは、十分なコントラストと個々 の繊維を視覚化する解像度の常に許可しています。ミエリンを検出するための代替アプローチ ミエリン蛋白に対する免疫組織化学化です。様々 な抗体を高い特異性ミエリン特異的抗原をターゲットし、有髄の構造を検出する日常的に使用することができます。抗体抗原の相互作用はすることができます一次抗体に対して指示、適切な蛍光顕微鏡による可視化の蛍光体に結合された二次抗体を使用してさらに明らかにしました。ここでは、神経組織アーキテクチャのよい保存可能モデル ex vivo 小脳スライスのミエリンを染色する免疫プロトコルについて述べる。また、組織とプルキンエ細胞 (小脳の唯一の有髄ニューロン) のサイズは電気生理学的研究のための古典的なモデルをそれら、彼らは同様に固定またはライブ イメージングの研究を行うことが理想的。
小脳のスライスは、プルキンエ細胞髄鞘形成、ex vivo (DIV in vitro で 6-7 日)15の 1 週間によって大抵達成されるプロセスの早期発生に対応する時間を P9 P10 マウスから生成されます。このモデルは脱髄性疾患多発性硬化症 (MS) などを調査するため適応 myelinotoxic 複合リゾホスファチジルコリンにより (または、リゾレシチン、LPC)、小脳スライスで大規模な脱髄を誘起すること、さらに、自発的な検査16,17が続いています。内因性検査培地から LPC 除去後 2 日から行われます、ほぼ完全に週後の治療です。
このプロトコルの完了小脳スライス文化準備、脱髄のピークに達する 2 日続いて完全に有髄のスライスを取得する週彼らの完全に別の週に半日を含む approximatively 3 週間はかかる検査。さらに、免疫組織化学は、2 日間で完了できます。ここで説明されているプロトコルは、標準 6 マウスの子犬のくずに適応され、計画の実験に使用される動物の数に関する適応する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、我々 の元を生成するプロトコル詳細公開メソッド15,16,19後続のミエリン以前からマウス小脳脊髄スライス培養に対応する生体モデルの適応これらの製剤の免疫染色。この戦略では、健康と病的状態の高分解能髄鞘成分を可視化する可能性を提供しています。
小脳脊髄スライス培養 10 日齢の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿上の貴重なコメント、ショーン ・ フリーマン博士、博士ナタリー ゾル-Foulon と博士トーマス ・ ルーに感謝します。INSERM、ICM、ARSEP 補助金 R13123DD、(西暦) に ANR R17127DD FRM の交わり (西暦) に SPF20110421435 によって資金が供給されたこの仕事 (ティルソン) に FDT20170437332。セリスの細胞培養と icm に感謝しますクワント イメージング プラットフォーム。
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
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