Summary

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

Published: March 20, 2019
doi:

Summary

Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

Abstract

No sistema nervoso, mielina é uma estrutura complexa membrana gerada pela microambiental glial cells, que ensheathes de axônios e facilita a condução elétrica rápido. Alteração da mielina foi mostrada para ocorrer em várias doenças neurológicas, onde é associado com déficits funcionais. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um ex vivo modelo consiste em fatias cerebelar organotypic do mouse, que podem ser mantidas em cultura por várias semanas e ainda mais ser rotulado para visualizar a mielina.

Introduction

Os neurônios são células altamente polarizadas, que compõem um compartimento somato-dendríticas que recebe entradas do seu ambiente e um axônio que garante a geração e a propagação de impulsos elétricos para outras células. Propagação rápida e entrega oportuna de informações é essencial para o bom funcionamento do sistema nervoso. Nos vertebrados, isto é facilitado pela mielinização, que permite aumentar a velocidade de condução axonal1. Mielina é uma estrutura especializada, formada por camadas compactadas de membrana de plasma gerada pela microambiental glia, nomeadamente oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC) e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP). Tanto no SNC e o SNP, interações axoglial conduzir a formação de domínios axonal especializados: os nós de Ranvier e sua envolvente domínios, paranodes e juxtaparanodes2. Os segmentos axonal isolados por mielina, ou entrenós, alternadas com os nós de Ranvier, que correspondem a pequenos domínios amielínicas enriquecidos em canais de sódio voltagem-dependentes (atv). A alta concentração e ativação rápida de canais dev at aos nós de Ranvier permitir a regeneração dos potenciais de ação e em conjunto com as propriedades de isolamento das bainhas de mielina, assegurar a condução eficiente e rápido insulada do impulso nervoso ao longo do axônio3.

Além de seu papel em acelerar a velocidade de condução do impulso nervoso, microambiental glia fornece suporte metabólico para o axônio, preservando sua integridade a longo prazo e participando de sua sobrevivência4,5. Além disso, é evidente em anos recentes que a mielina é modulada dinamicamente ao longo da vida, assim, presumivelmente participando de regulamento e plasticidade das várias funções do sistema nervoso. Ajustes da distribuição, número, comprimento e espessura das bainhas de mielina ao longo do axónio, portanto, podem representar uma nova maneira para ajustar finamente várias redes6,7,8. Portanto, a aquisição evolutiva de mielina é um processo chave para funções sensoriais, motoras e cognitivas e a perturbação da interação entre axônios e glia é cada vez mais considerada como contribuindo para o desenvolvimento ou adquirida neurológica doenças9.

Composição de mielina tem sido caracterizada, com a característica específica de uma elevada percentagem de lípidos (70%) em comparação com as proteínas (30%) em contraste com outras membranas celulares10. No entanto, ao contrário de lipídios de mielina, a maioria das proteínas da mielina é específica para mielina, incluindo a proteína básica da mielina (MBP), proteína proteolipid (PLP), 2′, glicoproteína de 3′-fosfodiesterase (CNP), associada a mielina de nucleotídeos 3′-cíclico (MAG), glicoproteína mielina-oligodendrocyte (MOG), PMP-22 e P010. Histológicos existem vários métodos para manchar a mielina com base na sua composição de lipídios, tais como Luxol rápido azul11, Sudão negro B12, Baker hematina ácida método13, bem como prata coloração de14. No entanto, essas abordagens não sempre permite um contraste adequado e resolução para visualizar as fibras individuais. Uma abordagem alternativa para detectar mielina é através de imuno-histoquímica dirigido contra as proteínas da mielina. Vários anticorpos antígenos específicos de mielina de destino com uma alta especificidade e podem ser usados rotineiramente para detectar estruturas mielinizadas. A interação antígeno-anticorpo pode ser revelada ainda mais usar um anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo dirigido contra o anticorpo primário e visualizado com microscopia de fluorescência adequada. Aqui, descrevemos um protocolo imunoquímico para manchar a mielina em ex vivo cerebelar fatias, um modelo que permite uma boa preservação da arquitetura do tecido nervoso. Além disso, a organização e o tamanho das células de Purkinje (o único neurônio mielinizada do cerebelo) torná-los um modelo clássico para Estudos eletrofisiológicos e eles são da mesma forma ideais para realizar estudos fixos ou imagens ao vivo.

As fatias Cerebelares são geradas a partir de ratos P9-P10, um tempo correspondente do início da célula de Purkinje mielinização, um processo que é principalmente alcançado por uma semana ex vivo (6-7 dias in-vitro, DIV)15. Além disso, este modelo é adaptado para investigar distúrbios desmielinizantes como esclerose múltipla (MS), como uma desmielinização extensa pode ser induzida em fatias Cerebelares usando o myelinotoxic composto lysophosphatidylcholine (ou lysolecithin, LPC), Qual é seguida por um espontâneo como16,17. Como endógeno ocorre dois dias após a remoção de LPC, meio de cultura e é quase completo de um tratamento de post da semana.

A conclusão do presente protocolo leva cerca de 3 semanas, incluindo a metade de um dia para a preparação de culturas cerebelar fatia, uma semana para obter fatias totalmente mielinizadas, seguidas por 2 dias para atingir o pico de desmielinização e mais uma semana para seu pleno mielinogênese. Além disso, a imuno-histoquímica pode ser concluído em 2 dias. O protocolo descrito aqui é adaptado um padrão ninhada de 6 filhotes de ratos e precisa ser adaptado em relação ao número de animais utilizados para o experimento planejado.

Protocol

Todos os trabalhos que envolvam animais respeitadas condições institucionais e orientações estabelecidas pela UPMC, INSERM e o francês e Europeu directiva comunitária 86/609/CEE. 1. preparação do meio de cultura e cultura insere (hands-on tempo ≈ 10 – 15 min) Nota: Execute esta etapa em uma capa de cultura de fluxo sob condições estéreis Prepare-se 40 mL do meio de cultura, que consiste em 50% BME, equilibrada solução 25% …

Representative Results

Exemplos de mielina representante immunostainings em organotypic cerebelar fatias obtidas P9 P10 C57black6 tipo selvagem (WT) (Figura 2A), bem como ratos transgénicos PLP-GFP (Figura 2B), juntamente com células de Purkinje coloração. Myelinate de substância branca Cerebelares fatias faixas região das fatias em direção a periferia da folia e mielinização das células de Purkinje é principalmente alcançada depois de 6 a…

Discussion

Aqui, detalhamos um protocolo para gerar um ex vivo modelo correspondente para as culturas de fatia de rato organotypic cerebelar, adaptado de anteriormente métodos publicados15,16,19 e a mielina subsequente immunostaining dessas preparações. Esta estratégia oferece a possibilidade de visualizar os componentes da mielina com uma alta resolução em Estados saudáveis e patológicos.

Organotypic ce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon e Dr. Thomas Roux por valiosos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, ICM, ARSEP subsídios R13123DD, R17127DD ANR (a D.C.) e comunhão FRM, SPF20110421435 (a A.D.), FDT20170437332 (para M.T.). Agradecemos a estrutura de cultura de células CELIS e o icm. Plataforma de imagem Quant.

Materials

BME medium ThermoFisher Scientific 41010026
Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) ThermoFisher Scientific 14180046
GlutaMAX (100X) ThermoFisher Scientific 35050038
Heat-inactivated Horse Serum ThermoFisher Scientific 26050088
Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Gey’s Balanced Salt Solution Sigma Aldrich G9779-500ML
D-Glucose Solution (45%) Sigma Aldrich G8769-100ML
Lysophosphatidylcholine (LPC) Sigma Aldrich L4129-100MG
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15714
Absolute ethanol (100% ethanol) VWR Chemicals 20821.330 Cooled at -20°C
Triton® X-100 Sigma Aldrich X100-500ML
10% Normal Goat Serum (NGS) ThermoFisher Scientific 500622
Phosphate Buffer Solution EuroMEDEX ET330-A pH 7.4
Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) Merck Millipore 06-896 Dilution 1/300
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) Merck Millipore AB9348 Dilution 1/150
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) Merck Millipore NE1019 Dilution 1/200
Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan Dilution 1/5 to 1/10
Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) Sigma Aldrich S8809 Dilution 1/150
Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) Abcam ab34151 Dilution 1/500
Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 ThermoFisher Scientific Dilution 1/500
Fluoromount SouthernBiotech 0100-20
Tissue chopper McIlwain
Razor blades
Large scissors F.S.T 14101-14
Small scissors F.S.T 91500-09
Fine-straight forceps F.S.T 91150-20
Curved-fine forceps F.S.T 11297-00
Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) TPP
4-, 6-well culture plates TPP
Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) Merck Millipore PICM0RG50
Cell culture incubator 37°C, 5% CO2
Fine-end pipette tips Dutscher 134000CL
Wide-bore pipette tips ThermoFisher Scientific 2079G
Sterile syringe Terumo Europe 20 or 50 mL
Sterile syringe filters Terumo Europe 0.22 µm
Scalpel Swann-Morton 0510
Brush
Microscope slides RS France 76 x 26 x 1.1 mm
Glass coverslips RS France 22 x 22 mm
Kimtech Sciences Tissue Wipers Kimberly-Clark Professional 5511
Binocular microscope

References

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Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (145), e59163, doi:10.3791/59163 (2019).

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