Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim
Summary
Bu çalışmada FcγR etkinleştirilmesinden kaynaklanan Reaktif oksijen türleri (ROS) üretim algılamak için Akış Sitometresi kullanımını gösterir. Bu yöntem değişiklikleri antimikrobiyal ve fagositler yanıt bağışıklık kompleksleri, opsonized mikroorganizmalar veya doğrudan FcγR cross-linking fonksiyonlu Redoks değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Oksidatif veya solunum aşırı oksijen tüketiminin hızlı ve Reaktif oksijen türlerine (ROS) nesil açıklamak için çeşitli bağışıklık uyaranlara yanıt olarak fagositler tarafından kullanılır. ROS bağışıklık etkinleştirme sırasında oluşturulan aracılığıyla öncelikle ROS yeteneklerini DNA ve proteinler, zarar vermek için güçlü antimikrobiyal aktivitesi mikroorganizmaların ölümüne neden olan uygular. ROS üretim tekrarlanarak ve kolaylıkla ölçmek için güçlü olmak çeşitli yollar ve bu konak savunma mekanizmasının moleküllerine katkısını değerlendirmek için gereklidir. Bu kağıt, floresan problar kullanımını gösteren ve Akış Sitometresi ROS üretim algılamak için. Her ne kadar yaygın olarak kullanılan, ROS floresan ölçümü rootkitler, özel ve değil mitogenic uyaranlara tarafından indüklenen ROS ölçümü açısından özellikle problemlidir. Biz makrofaj üretimi, astar, Boyama, FcγR cross-linking ve akış sitometrik çözümlemesi ile biten başlayarak belirli FcγR uyarılması sonucu olarak oluşturulan ROS algılamak için detaylı bir metodoloji mevcut.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS) reaktif molekülleri veya serbest radikallerin yan ürünleri ( 1‘ de gözden) Aerobik solunum vardır. Bunlar, süperoksit anyon, peroksit, hidrojen peroksit, radikal hidroksil ve hidroksil iyonları, diğerleri arasında içerir. Normal fizyolojik şartlarda ROS esas olarak mitokondri ve Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oxidases tarafından üretilen ve çeşitli enzimler ve protein süperoksit dismutaz ve glutatyon gibi hızla detoxified. ROS veya ROS çıkarılması yeteneğini bir üründe abartılı bir üretim oksidatif stres, mademki proteinler, lipidler ve hücresel stres ya da ölüm ve patolojik hastalık durumlarında yol DNA hasar Reaktif oksijen türleri teşvik neden olabilir. Ancak, bu şu anda ROS de sinyal molekülleri (redoks sinyal) hareket edebilir ve çeşitli moleküller ve yolu ara ürün ROS-aracılı değişiklik etkileyebilir hücresel metabolizma, nükleer silahların yayılmasına karşı hayatta kalma, inflamatuar beğeni topluyor sinyalizasyon ve2yaşlanma. Fagositik hücreleri, ROS antimikrobiyal aktivite sırasında sözde “solunum patlama”1,3,4,5,6sağlayan önemli bir rol oynar. Dış uyaranlara karşı fagositler tepki sırasında NADPH oksidaz karmaşık (p40phox, p47phox, p67phox) bileşenlerinin sitozol gp91phox ve p22phox içeren phagosomal membran translocate alt birimleri, ve Rac1/2 eylemleri ile birlikte, bir tam işlevsel NADPH oksidaz enzimi karmaşık form. Birleştirilmiş NADPH oksidaz sonra NADPH oksijen süperoksit phagosomal çarpıtması içinde azaltmak için kullanır. Süperoksit anyon doğrudan zarar verebilir ya da hidrojen peroksit dismutated. Süperoksit ve hidrojen peroksit büyük ölçüde reaktif hidroksil radikalleri oluşturmak için diğer molekülleri ile tepki verebilir. Hasar bu ROS proteinler kümelerde demir-kükürt ile reaksiyon veya sonuçta kısıtlı mikrobiyal metabolizma veya mikrop5ölüm önde gelen DNA’ın temel oksidasyon neden aracılık ettiği. ROS esnasında solunum patlamış üretilen ve NADPH oksidaz enzimi karmaşık önemi resimli klinik hastalarda kronik Granulomatous hastalığı (ÇGD)7,8,9, 10. CGD olan bireyler sahip gp91phox, mutasyonların ROS üretim ve bakteri ve mantarlar genellikle immün bireyler ile bir endişe olmayan tekrarlayan enfeksiyonlara yatkınlık eksikliği sonuçlanan. Bu nedenle, oksidatif stres, Redoks Sinyal veya ana savunma, varlık ölçmek mümkün eğitim ROS üretim gerçek zamanlı olarak yararlı bir çaba olup.
Tedbir ROS üretim veya oksidatif stres11,12,13sonuçlarını birden çok testleri kullanılmıştır. Bunlar arasında en çok kullanılan biridir floresan sonda 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-DA)14. Bu renksiz ve lipofilik moleküldür. DCFH2-DA hücre zarı arasında Difüzyon hücre içi esterazlar tarafından üzerine hareket hangi hücre geçirimsiz işleme DCFH2, deacetylates sağlar. ROS (hidrojen peroksit, peroxynitrite, hidroksil radikalleri, nitrik oksit ve peroxy radikaller) DCFH2 üzerinde birden çok türde eylemler floresan olan DCF okside (Ex bildirilen / Em: 485-500 nm/515-530 nm) ve bir akış kullanarak tespit edilebilir sitometresi floresein (FL1 kanal) için ayarla Standart filtre ile donatılmıştır. Süperoksit şiddetle DCFH2 ile cevap vermiyor ama floresan ürün 2-hydroxyethidium (yanı sıra diğer floresan süperoksit bağımsız oksidasyon ürünleri)15verim için başka bir sonda dihydroethidium ile (DHE) tepki verebilir. DHE oksidasyon floresan ürünlerin bir uyarma dalga boyu 518 kullanarak tespit edilebilir nm ve emisyon dalga boyu 605 nm (FL2 kanal). Bu sondalar ROS algılanması için kullanımı gerektirir onların sınırlamalar bilgi ve yordamlar ve denetimleri geçerli olması için gerçekleştirilen özel tahlil içine deneysel boyama dikkatli ana kullanmak nispeten basit olmasına rağmen sonuçları ve sonuçlara. Aşağıdaki iletişim kuralı tarafından Akış Sitometresi ROS ölçmek için tasarlanmış bu 2 probları istihdam bir ticari olarak mevcut kit kullanımı gösterilmiştir. Bu sonda ile astarlanmış kemik iliği türevi makrofajlar leke ve FcγR cross-linking aracılığıyla ROS üretim teşvik. Bu iletişim kuralı kullanılarak elde temsilcisi verileri sunmak ve başarılı deneme için üstlenilen uygun önlemler stres.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-DA ve DHE tabanlı algılama ROS, yaygın olarak kullanılan teknik14,15var. Kullanım kolaylığı ve Kinetik Mikroplaka biçimleri için bu ROS probları adaptasyon, floresan mikroskopi veya akış sitometrik analiz onların popülerlik için katkıda bulunmuştur. Ancak, çalışmalarımız FcγR-aracılı makrofaj fonksiyonların, değil gibi görünüyor bu tahlil için FcγR çapraz bağlı hücre akış sitometrik çözümlemesi gerçekle?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Tigno-Aranjuez Laboratuvar Laboratuvar bakım ve fare koloni bakım yardım için Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy ve Roopin Singh gibi diğer üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma için destek hibe R00 HL122365 ve J.T.T-A. başlangıç fonlar tarafından sağlanan
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
