Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.
Summary
Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique. En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.
Abstract
Contamination par les aflatoxines dans les cultures de l’alimentation humaine et animale est un défi majeur dans le monde entier. Les aflatoxines, produites par le champignon Aspergillus flavus (a. flavus) sont des agents cancérigènes qui réduisent considérablement la valeur des récoltes de maïs et autres plantes oléagineuses riches comme l’arachide en plus qui posent une menace sérieuse pour la santé humaine et animale. Différentes approches, y compris la reproduction traditionnelle, transgénique expression des protéines de résistance liée et l’interférence ARN (Arni)-base de gène induite par le hôte faire taire des critiques a. flavus gènes cibles, sont envisagées pour augmenter résistance d’aflatoxine dans les cultures sensibles. Des études antérieures ont montré un rôle important de le α-amylase dans la production de pathogénie et d’aflatoxines a. flavus , suggérant cette gène/enzyme est une cible potentielle pour réduire la croissance d’a. flavus et la production d’aflatoxine. À cet égard, la présente étude visait à évaluer l’expression hétérologue (sous contrôle du promoteur CaMV 35 s constitutif) d’une protéine de type inhibiteur de α-amylase Lablab purpureus L. (AILP) chez le maïs contre a. flavus. AILP est une protéine de 36 kDa, qui est un inhibiteur compétitif de l’enzyme α-amylase a. flavus et appartient à la famille de protéine inhibiteur de la lectine – arcelin – α-amylase en commun haricot. Des études in vitro avant les travaux en cours avaient démontré le rôle de AILP dans l’inhibition de l’activité de le α-amylase a. flavus et la croissance fongique. La croissance fongique et la production d’aflatoxine dans les grains mûrs ont été suivis en temps réel en utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus . Ce noyau screening test (KSA) est très simple à mettre en place et fournit des données fiables et reproductibles sur les maladies infectieuses et le degré de propagation qui ont pu être quantifiée pour l’évaluation des ressources génétiques et les lignées transgéniques. La fluorescence de la souche GFP est étroitement corrélés aux champignons de la croissance et, par extension, il est bien corrélé aux valeurs de l’aflatoxine. Les travaux en cours visait à mettre en œuvre cette connaissance préalable dans une récolte commercialement importante comme le maïs pour augmenter la résistance de l’aflatoxine. Nos résultats montrent une réduction de 35 % à 72 % de croissance d’a. flavus dans les grains transgéniques maïs exprimant l’AILP qui, à son tour, traduit par une réduction de 62 % à 88 % dans les niveaux d’aflatoxine.
Introduction
Contamination par les mycotoxines par les genres fongiques, Alternaria , Fusarium, Penicilliumet Aspergillusest un problème majeur de la nourriture et nourrissent de plantes cultivées dans le monde1,2,3. Parmi ces champignons phytopathogènes, Aspergillus a le plus d’impact défavorable sur la valeur des récoltes et de la santé humaine et animale. Aspergillus flavus (A. flavus) est un plante opportuniste pathogène qui infectent les plantes oléagineuses riches telles que le maïs, le coton et d’arachide et produit les agents cancérigènes, aflatoxines, ainsi que de nombreux métabolites secondaires toxiques (SMs). Le maïs est un aliment important et nourrir des cultures dans le monde entier et est très sensible à la contamination par a. flavus. L’impact économique de la contamination par les aflatoxines sur perd et valeur réduite chez le maïs peut être autant que $ 686,6 millions/an dans l’US2 avec les changements prévus dans le climat mondial, l’incidence des aflatoxines peut entraîner de plus grandes pertes économiques dans le maïs avec aussi hautes que $ 1,68 milliards/an dans le futur proche2estimations. Étant donné les conséquences économiques et sanitaires des aflatoxines chez les humains et le bétail, contrôle avant la récolte aflatoxines dans le maïs peut être le moyen le plus efficace pour prévenir la contamination par les aflatoxines dans les denrées alimentaires et aliments pour animaux.
L’approche du contrôle de pré-récolte majeur pour la résistance des aflatoxines dans le maïs qui a été largement utilisé dans les dernières décennies est principalement par le biais de sélection, ce qui nécessite une quantité importante de temps4. Récemment, biocontrol a eu un certain succès dans la réduction des aflatoxines dans la zone de grande échelle pour les applications5,6. En plus de la lutte biologique, application de pointe outils moléculaires tels que « Hôte induite par Gene Silencing » (HIGS) par le biais de RNAi et expression transgénique de protéines associées à la résistance a eu un certain succès dans la réduction de la croissance d’a. flavus et d’aflatoxines production dans les études de laboratoire et de terrain à petite échelle. Ces approches sont actuellement en cours d’optimisation en plus de l’identification de nouvelles cibles potentielles de gène a. flavus pour manipulation future.
Outre les gènes qui sont directement impliqués dans la production de mycotoxines comme cibles potentielles des stratégies de lutte transgéniques, amylases fongiques auraient dû être divulgués à jouer un rôle crucial dans le maintien de production réussie de pathogénie et de mycotoxine pendant les premiers stades de l’infection des plantes hôtes. Quelques exemples incluent Pythium pleroticum (agent causal de la pourriture du rhizome de gingembre), Fusarium solani (agent causal de la flétrissure de chou-fleur), où des corrélations positives entre la pathogénicité et le α-amylase expression et l’activité ont été observées à 7,,8. Inhibition de l’activité de le α-amylase par knock-out du gène ou approches knockdown affecte négativement la production de toxine et de croissance fongique. Un mutant de knock-out de α-amylase d’a. flavus a été incapable de produire des aflatoxines lorsqu’il est cultivé sur amidon substrat ou dégermées grains de maïs9. De même, au Fusarium verticillioides une souche de α-amylase n’ont pas produit de fumonisine B1 (mycotoxines) au cours de l’infection des grains de maïs10. Dans une étude plus récente, Gilbert et coll. (2018) ont montré qu’un axée sur l’ARNi Démantelez d’a. flavus expression de α-amylase par HIGS significativement réduit a. flavus production de croissance et d’aflatoxines pendant l’infection noyau maïs11 .
Inhibiteurs spécifiques de l’activité de le α-amylase ont également produit des résultats similaires obtenus de down-régulation de l’expression de le α-amylase. Le premier rapport sur le rôle d’un inhibiteur de le α-amylase fongique résistance provenait de l’isolement et la caractérisation d’un inhibiteur de la trypsine-α-amylase 14 kDa de lignées de maïs résistants à a. flavus12. Outre le dépistage de plusieurs centaines d’espèces de plantes par Fanfan et Woloshuk conduit à l’identification d’une protéine de type inhibiteur de α-amylase 36 kDa (AILP) des graines de haricots de Jacinthe, Lablab purpureus L.13. La séquence peptidique de lectines AILP ressemblait à appartenant à la famille de l’inhibiteur de la lectine – arcelin – α-amylase déclarés en commun haricot14,15. AILP purifiée ne présente pas toute activité inhibitrice envers la trypsine mammifères et plus de caractérisation in vitro ont montré une inhibition significative de la croissance d’a. flavus et la germination des conidies13. Les rapports présentés ici clairement montre α-amylase peut servir d’objectif dans les approches de contrôle pour limiter les agents pathogènes ou parasites qui dépendent de la mobilisation d’amidon (à travers l’activité de le α-amylase) et l’acquisition des sucres solubles comme source d’énergie au cours de leur pathogène interaction avec les plantes hôtes.
Alpha-amylase est connu pour être critique dans a. flavus pathogénicité9,10,11et compte tenu de l’importance de AILP comme un puissant anti-a. flavus agent (α-amylase inhibition/antigrowth)13, Nous avons généré des plants de maïs transgéniques exprimant Lablab AILP gène sous le promoteur CaMV 35 s constitutif. Le but était de vérifier si une expression hétérologue de cet inhibiteur de le α-amylase dans le maïs est efficace contre a. flavus pathogenèse et aflatoxine production au cours de l’infection de noyau de maïs. Nos résultats démontrent que les grains de maïs transgéniques exprimant AILP significativement réduit l’a. flavus croissance et aflatoxine production au cours de l’infection de noyau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des pertes de rendement dans les cultures agricoles en raison des agents pathogènes et parasites est un problème mondial20. Actuellement, application de pesticides et fongicides synthétiques est le moyen prédominant pour contrôle pathogènes et parasites, mais toxicité résiduelle de ces substances biochimiques dans l’alimentation humaine et animale peut constituer une menace sérieuse pour la santé humaine et animale,21. Compte tenu de l’importance économique d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions David Meints, Université de l’Arkansas pour son aide dans l’élaboration et l’analyse du maïs transgénique au cours des premières générations. Cet ouvrage a reçu le soutien financier du projet de l’USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. La mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cet article est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou une approbation par le US Department of Agriculture. Offre d’emploi égale (EEO) politique des USDA-ARS exige l’égalité des chances pour toutes les personnes et interdit la discrimination dans tous les aspects des politiques relatives au personnel, pratiques et opérations de l’Agence.
Materials
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
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