Inibizione di crescita di Aspergillus flavus e produzione di aflatossina nel mais transgenici che esprimono la α-amilasi inibitore da Dolichos lablab L.
Summary
Qui presentiamo un protocollo per analizzare Aspergillus flavus crescita e produzione di aflatossina in chicchi di mais che esprime una proteina di antimicotica. Usando un ceppo che esprimono GFP a. flavus abbiamo controllato l’infezione e la diffusione del fungo nei kernel maturo in tempo reale. Il test è rapido, affidabile e riproducibile.
Abstract
Contaminazione da aflatossina nelle colture di alimenti e mangimi è una sfida importante in tutto il mondo. Le aflatossine, prodotte dal fungo Aspergillus flavus (a. flavus) sono agenti cancerogeni potenti che sostanzialmente riducono il valore di ritaglio in mais e altre colture ricche di olio come arachidi oltre che propongono una minaccia seria per la salute umana e animale. Diversi approcci, tra cui allevamento tradizionale, espressione transgenica di resistenza associata proteine e RNA interference (RNAi)-base di silenziamento genico indotto da host di critica a. flavus geni bersaglio, vengono valutate per aumentare resistenza di aflatossina nelle colture sensibili. Studi precedenti hanno mostrato un ruolo importante di α-amilasi in produzione patogenesi e aflatossina a. flavus , suggerendo questo gene/enzima è un potenziale bersaglio per ridurre sia la crescita di a. flavus che la produzione di aflatossina. A questo proposito, lo studio corrente è stato intrapreso per valutare l’espressione eterologa (sotto il controllo del promotore 35S CaMV costitutivo) di una proteina del tipo di inibitore della α-amilasi Dolichos lablab L. (AILP) nel mais contro a. flavus. AILP è una proteina di 36-kDa, che è un inibitore competitivo dell’enzima α-amilasi a. flavus e appartiene alla famiglia delle proteine lectine – arcelin – α-amilasi inibitore in comune con fagioli. Studi in vitro prima di iniziare il lavoro corrente avevano dimostrato il ruolo di AILP nella inibizione dell’attività α-amilasi a. flavus e crescita fungina. Crescita fungina e produzione di aflatossina in granella maturo sono stati monitorati in tempo reale utilizzando un ceppo che esprimono GFP a. flavus . Questo kernel lo screening test (KSA) è molto semplice da configurare e fornisce dati affidabili e riproducibili su infezione e il grado di diffusione che poteva essere quantificati per la valutazione di germoplasma e linee transgeniche. La fluorescenza dal ceppo GFP è strettamente correlata alla fungine crescita e, per estensione, è ben correlata ai valori di aflatossina. L’obiettivo del lavoro attuale era di implementare questa conoscenza precedente in una coltura commercialmente importante come il mais per aumentare la resistenza di aflatossina. I nostri risultati mostrano una riduzione del 35%-72% in crescita di a. flavus nei kernel mais transgenici esprimenti AILP che, a sua volta, si traduce in una riduzione del 62%-88% nei livelli di aflatossina.
Introduction
Contaminazione da micotossine di generi fungini, Aspergillus, Fusarium, Penicilliume Alternaria è un grave problema di cibo e mangimi coltivati in tutto il mondo1,2,3. Tra questi funghi fitopatogeni, Aspergillus ha il più alto impatto negativo sul valore delle colture e salute umana e animale. Aspergillus flavus (A. flavus) è un agente patogeno opportunistico pianta che infetta ricca oleaginose quali mais, semi di cotone e arachidi e produce i potenti cancerogeni, aflatossine, così come numerosi metaboliti secondari tossici (SMs). Mais è un alimento importante e nutrire le colture di tutto il mondo ed è altamente sensibili alla contaminazione da a. flavus. L’impatto economico della contaminazione da aflatossine su perde e valore ridotto in mais può essere tanto quanto $ 686,6 milioni/anno in US2 con i previsti cambiamenti nel clima globale, l’impatto delle aflatossine potrebbe comportare perdite economiche maggiore nel mais con stime su quanto $ 1,68 miliardi/anno nel vicino futuro2. Dato gli effetti economici e sanitari delle aflatossine negli esseri umani e bestiame, controllo di pre-raccolta aflatossine nel mais potrebbe essere il modo più efficace per prevenire la contaminazione da aflatossine negli alimenti e mangimi.
L’approccio di controllo principale di pre-raccolta per resistenza di aflatossine nel mais che è stato ampiamente utilizzato in questi ultimi decenni è principalmente attraverso l’allevamento, che richiede una notevole quantità di tempo4. Recentemente, biocontrol ha avuto certo successo nella riduzione di aflatossina in larga scala campo applicazioni5,6. Oltre biocontrollo, applicazione di strumenti molecolari all’avanguardia come ‘Host indotto silenziamento genico’ (Villa) attraverso la RNAi e transgenici espressione di proteine associate a resistenza ha avuto un certo successo nella riduzione della crescita di a. flavus e aflatossina produzione in studi di laboratorio e sul campo di piccola scala. Questi approcci sono attualmente in fase di ottimizzazione oltre a individuare nuovi potenziali target di gene a. flavus per modifica futura.
Oltre a geni che sono direttamente coinvolti nella produzione di micotossine come potenziali obiettivi delle strategie di controllo transgenici, amilasi fungine hanno dimostrate di giocare un ruolo critico nel mantenimento della produzione di patogenesi e micotossine successo durante le fasi iniziali di infezione di pianta ospite. Alcuni esempi includono Pythium pleroticum (agente eziologico della putrefazione di zenzero rizoma), Fusarium solani (agente causale della verticillosi cavolfiore), dove le correlazioni positive tra espressione di patogenicità e α-amilasi e attività sono state osservate 7,8. Inibizione dell’attività α-amilasi tramite knockout del gene o approcci atterramento influenza negativamente la produzione della tossina e di crescita fungina. Un mutante di knockout di α-amilasi di a. flavus è stato in grado di produrre aflatossine quando coltivate su amido substrato o degermed chicchi di mais9. Allo stesso modo, in Fusarium verticillioides un ceppo di knockout di α-amilasi non è riuscito a produrre fumonisina B1 (micotossine) durante l’infezione di chicchi di mais10. In uno studio più recente, Gilbert et al (2018) hanno dimostrato che una basata su RNAi abbattere di espressione di α-amilasi a. flavus attraverso Villa ridotto significativamente a. flavus crescita e aflatossina produzione durante l’infezione del kernel mais11 .
Inibitori specifici dell’attività α-amilasi hanno anche prodotto risultati simili come ottenuti da giù-regolamento dell’espressione di α-amilasi. Il primo rapporto sul ruolo di un inibitore di α-amilasi fungina resistenza è venuto dall’isolamento e la caratterizzazione di un inibitore della tripsina-α-amilasi 14-kDa da linee di mais resistente a. flavus12. Ulteriori controlli di diverse centinaia di specie di piante da fattori e Woloshuk ha portato all’identificazione di una proteina di kDa 36 α-amilasi inibitore-come (AILP) dai semi di fagioli di Giacinto, Dolichos lablab L.13. La sequenza del peptide di lectine AILP somigliava appartenente alla famiglia delle lectine – arcelin – α-amilasi inibitore segnalato in comune fagiolo14,15. AILP purificato non presenta alcuna attività inibitoria nei mammiferi tripsina e ulteriore caratterizzazione in vitro ha mostrato l’inibizione significativa di crescita a. flavus e germinazione conidial13. Le relazioni presentate qui chiaramente spettacoli α-amilasi possono servire come una destinazione negli approcci di controllo per limitare gli agenti patogeni o parassiti che dipendono dalla mobilitazione di amido (attraverso attività di α-amilasi) e acquisizione di zuccheri solubili come fonte di energia durante il loro patogeno interazione con piante ospiti.
Alfa-amilasi sono conosciuto per essere critici a. flavus patogenicità9,10,11e data l’importanza dell’AILP come un potente anti-a. flavus agente (α-amilasi inibizione/antigrowth)13, Abbiamo generato piante di mais transgeniche esprimenti Lablab AILP gene sotto il promotore CaMV 35S costitutivo. L’obiettivo era di studiare se l’espressione eterologa di questa α-amilasi inibitore nel mais è efficace contro a. flavus patogenesi e aflatossina produzione durante l’infezione del kernel mais. I nostri risultati dimostrano che chicchi di mais transgenici che esprimono AILP significativamente ridotto a. flavus crescita e aflatossina produzione durante l’infezione del kernel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Perdite di rendimento dovute a colture agricole a causa di agenti patogeni e parassiti è un problema globale20. Attualmente, applicazione dei fungicidi sintetici e pesticidi è il mezzo predominante per controllo impianto patogeni e parassiti, ma tossicità residua di queste sostanze biochimiche in alimenti e mangimi possono costituire grave minaccia per la salute umana e animale21. Considerando l’importanza economica del mais come alimento e mangime raccolto, riduzione o …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringrazia David Meints, Università di Arkansas per la sua assistenza nello sviluppo e l’analisi il mais transgenico durante le prime generazioni. Questo lavoro ha ricevuto il sostegno finanziario del progetto USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. Menzione di marchi o prodotti commerciali in questo articolo è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Ministero dell’agricoltura. Politica di pari opportunità di occupazione (EEO) dei USDA-ARS mandati di pari opportunità per tutte le persone e vieta la discriminazione in tutti gli aspetti delle politiche del personale dell’Agenzia, pratiche e operazioni.
Materials
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
References
- Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
- Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
- Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
- Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies – a review. Food Additives & Contaminants – Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
- Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
- Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
- Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
- Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
- Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
- Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
- Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
- Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
- Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
- Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
- Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
- Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
- Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
- Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
- Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
- Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
- Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
- Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
- Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
- Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
- Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
- Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
- Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
- Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences – Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
- Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
- Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
- Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
- Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
- Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
- Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
- Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
- Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).
