JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
환경과학

Hämning av Aspergillus flavus tillväxt och Aflatoxin produktion i transgena majs uttrycker α-amylas-hämmaren från Kristina purpureus L.

Published: February 15, 2019
doi:
10.3791/59169
, , , ,
1Southern Regional Research Center,USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology,University of Arkansas

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att analysera Aspergillus flavus tillväxt och aflatoxin produktion i majs kärnorna uttrycker en svampdödande protein.  Använda en GFP-uttryckande A. flavus stam övervakade vi infektion och spridning av svampen i mogna kärnor i realtid. Analysen är snabba, tillförlitliga och reproducerbara.

Abstract

Aflatoxinkontaminering av livsmedels- och fodergrödor är en stor utmaning i hela världen. Aflatoxiner, producerad av svampen Aspergillus flavus (A. flavus) är potenta carcinogener som väsentligen minska gröda värdet i majs och andra olja rik grödor som jordnötter förutom utgör allvarliga hot mot människors och djurs hälsa. Olika metoder, inklusive traditionell avel, transgena uttryck för motstånd associerade proteiner och RNA-interferens (RNAi)-baserade värd-inducerad nedtystning av kritiska A. flavus gen mål, utvärderas för att öka aflatoxin motstånd i mottagliga grödor. Tidigare studier har visat en viktig roll av α-amylas i A. flavus patogenes och aflatoxin produktion, vilket tyder på denna gen/enzym är ett potentiellt mål att minska både A. flavus tillväxt och aflatoxin produktion. I detta avseende genomfördes den aktuella studien för att utvärdera heterologa uttryck (under kontroll av promotorn 35S konstituerande CaMV) av en Kristina purpureus L. α-amylas hämmare-liknande protein (AILP) i majs mot A. flavus. AILP är ett 36-kDa-protein, som är en kompetitiv hämmare av A. flavus α-amylas enzym och tillhör familjen lektin – arcelin – α-amylas-hämmare protein gemensamt bean. In vitro studier innan den nuvarande arbetet hade visat AILP roll i hämning av A. flavus α-amylas aktivitet och svamptillväxt. Svamptillväxt och aflatoxin produktion i mogna kärnor övervakades i realtid med hjälp av en GFP-uttryckande A. flavus stam. Denna kärna screening test (KSA) är mycket enkel att ställa in och ger tillförlitliga och reproducerbara data på infektion och omfattningen av spridningen som kunde kvantifieras för utvärdering av arvsmassa och transgena linjerna. Fluorescensen från GFP stammen är nära korrelerad till svamp tillväxt och, i förlängningen, det är väl korrelerade till aflatoxin värden.  Målet för det aktuella arbetet var att genomföra denna tidigare kunskap i en kommersiellt viktig gröda som majs att öka aflatoxin motstånd. Våra resultat visar en minskning på 35% – 72% i A. flavus tillväxt i AILP-uttryckande transgena majs kärnorna som, i sin tur översätts till en minskning med 62% – 88 procent av aflatoxin nivåer.

Introduction

Mykotoxiner av svamp släktena, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumoch Alternaria är ett stort problem av livsmedel och foder grödor som odlas i världen1,2,3. Bland dessa fytotoxiska svampar har Aspergillus den högsta negativa inverkan på gröda värde och människors och djurs hälsa. Aspergillus flavus (A. flavus) är en opportunistisk växt patogen som infekterar olja rik grödor som majs, bomullsfrö och jordnötter och producerar de potenta carcinogena, aflatoxiner, samt ett flertal giftiga sekundära metaboliter (SMs). Majs är en viktig föda och foder gröda som odlas över hela världen och är mycket mottagliga för kontaminering av A. flavus. De ekonomiska effekterna av aflatoxinföroreningar på förlorar och reducerade värdet i majs kan vara så mycket som $686.6 miljoner per år i USA2 med förväntade förändringar i globala klimatet, effekterna av aflatoxiner kan resultera i större ekonomiska förluster i majs med uppskattningar så högt som $1,68 miljarder per år i den nära framtida2. Med tanke på de negativa ekonomiska och hälsa effekterna av aflatoxiner i människor och boskap, kan före skörd aflatoxin kontroll i majs vara det mest effektiva sättet att hindra aflatoxinkontaminering av livsmedel och foderprodukter.

Den stora före skörd kontrollstrategi för aflatoxin motstånd i majs som har använts i stor utsträckning under de senaste decennierna är primärt genom avel, vilket kräver en betydande mängd tid4. Nyligen, Agrilus har haft viss framgång i aflatoxin minskning i stor skala fältet program5,6. Förutom Agrilus, har tillämpningen av banbrytande molekylära verktyg såsom ‘Host inducerad nedtystning’ (HIGS) via RNAi och transgena uttrycket av resistensassocierade proteiner haft viss framgång i minskning av A. flavus tillväxt och aflatoxin produktion i liten skala laboratorie- och fältstudier. Dessa metoder är för närvarande som optimeras förutom att identifiera nya potentiella A. flavus gen mål för framtida manipulation.

Förutom gener som är direkt involverade i mykotoxin produktion som potentiella mål av transgena kontrollstrategier, har svamp amylaser visat sig spela en avgörande roll i att upprätthålla framgångsrika patogenes och mykotoxin produktion under tidiga stadier av värd växten infektion. Några få exempel inkluderar Pythium pleroticum (kausal agent ingefära rhizom röta), Fusarium solani (kausal agent blomkål vissnesjuka), där positiva korrelationer mellan patogenicitet och α-amylas uttryck och aktivitet observerades 7,8. Hämning av α-amylas aktivitet antingen genom gen knockout eller knockdown förhållningssätt påverkar negativt svamp tillväxt och toxin produktion. En α-amylas knockout mutant av A. flavus kunde inte producera aflatoxiner när den odlas på stärkelse substrat eller degermed majs kärnorna9. Likaså i Fusarium verticillioides en α-amylas knockout stam kunde inte producera fumonisin B1 (mykotoxin) under infektion av majs kärnorna10. I en senare studie visat Gilbert et al. (2018) att en RNAi-baserade knock-down av A. flavus α-amylas uttryck genom HIGS avsevärt mindre A. flavus tillväxt och aflatoxin produktion under majs kernel infektion11 .

Hämmare av α-amylas aktivitet har också producerat liknande resultat som erhålls från down-förordning av α-amylas uttryck. Den första rapporten om rollen av en α-amylas hämmare svamp motstånd kom från isolering och karakterisering av en 14-kDa trypsin-α-amylas hämmare från majslinjer resistenta mot A. flavus12. Ytterligare screening av flera hundratals växtarter av Fakhoury och Woloshuk ledde till identifiering av ett 36-kDa α-amylas hämmare-liknande protein (AILP) från frön av hyacint bönor, Kristina purpureus L.13. Peptid sekvens av AILP liknade lektiner tillhör familjen lektin – arcelin – α-amylas-hämmare rapporterade gemensamt bean14,15. Renade AILP uppvisar inte någon hämmande aktivitet mot däggdjur trypsin och ytterligare in vitro-karakterisering visade signifikant hämning av A. flavus tillväxt och conidial grobarhet13. De rapporter som presenterades här tydligt visar α-amylas kan fungera som ett mål i kontroll metoder att begränsa patogener eller skadedjur som beror på stärkelse mobilisering (genom α-amylas aktivitet) och förvärvet av lösliga sockerarter som energikälla under deras patogena interaktion med värdväxter.

Alpha-amylas är kända för att vara kritisk i A. flavus patogenicitet9,10,11, och med tanke på betydelsen av AILP som en potent anti-A. flavus agent (α-amylas hämning/antigrowth)13, Vi genererat transgena majs växter uttrycker Kristina AILP gen under den konstituerande CaMV 35S-promotorn. Målet var att undersöka om heterologa uttryck för denna α-amylas hämmare i majs är effektivt mot A. flavus patogenes och aflatoxin produktion under majs kernel infektion. Våra resultat visar att transgena majs kärnorna uttrycker AILP avsevärt minskat A. flavus tillväxt och aflatoxin produktion under kernel-infektion.

Protocol

1. plasmid konstruktioner och majs omvandling PCR förstärka Kristina AILP infoga använder primers 5′-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 ‘och 5′-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3’. PCR-villkoren omfattar ett inledande denaturering steg vid 98 ° C i 30 s (steg 1), följt av denaturering i 98 ° C under 10 s (steg 2), glödgning vid 55 ° C i 30 s (steg 3), töjning vid 72 ° C för 20 s (steg 4), 31 cykler av steg 2 till 4 , och en slutlig töjning steg vid 72 ° C i 5 min. klon PCR-produkten till en mo…

Representative Results

Majs omvandling och molekylär screening av transgena växter Omogna embryon av Hi-II majslinjer omformades med hjälp av Agrobacterium tumefaciens EHA101 stam som innehåller den slutliga växt destination vektor uttrycker Kristina purpureus AILP genen under kontroll av CaMV 35S arrangören. Fem självständigt transformerad majslinjer var avancerade till T6 generation för e…

Discussion

Skördeförluster i grödor på grund av sjukdomsalstrare och skadedjur är ett globalt problem20. För närvarande tillämpningen av syntetiska fungicider och bekämpningsmedel är det dominerande sättet för kontrollerande växt sjukdomsalstrare och skadedjur, men resterande toxicitet av dessa biokemikalier i livsmedel och foder kan utgöra allvarliga hot mot människors och djurs hälsa21. Med tanke på den ekonomiska betydelsen av majs som livsmedel och foder grödan, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar David Meints, University of Arkansas för hans hjälp utveckla och analysera de transgena majsen under de tidiga generationerna. Detta arbete fick ekonomiskt stöd av USDA-ARS CRIS projektet 6054-42000-025-00D. Omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter i den här artikeln är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller bekräftelse av oss jordbruksdepartementet. USDA-ARS’ lika sysselsättning möjlighet (EEO) politiska mandat lika möjligheter för alla personer och förbjuder diskriminering i alla aspekter av byråns personalpolitik, metoder och åtgärder.

Materials

Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies – a review. Food Additives & Contaminants – Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences – Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Aspergillus FlavusAflatoxinMaizeTransgenicα-amylase InhibitorLablab PurpureusKernel Screening AssayGreen Fluorescent ProteinFungal InfectionAntifungal Properties
check_url/kr/59169?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image